Bahan Teknik Identifikasi.docx

Identifikasi bakteri dapat dilakukan secara FENOTIPIK (morfologi, fisiologi, biokimia) dan GENOTIPIK. Identifikasi secara fenotipik hanya dapat dilakukan untuk bakteri yang dapat dikulturkan (culturable), sedangkan identifikasi genotipik dapat dilakukan untuk bakteri yang dapat maupun tidak dapat dikulturkan (unculturable). Morfologi koloni bakteri meliputi bentuk, warna dan bau koloni dapat digunakan untuk identifikasi bakteri patogen tumbuhan. Pigmen yang dihasilkan merupakan hal penting dalam identifikasi awal bakteri. Namun beberapa bakteri patogen maupun non-patogen dapat memiliki koloni yang sama, sehingga identifikasi dengan morfologi koloni tidak akurat. Beberapa media semi selektif – diferensial telah tersedia untuk ddentifikasi bakteri berdasarkan morfologinya, misalnya TZCA untuk Ralstonia solanacearum (Gambar 1) dan King’s B untuk Pseudomonas kelompok fluoresence (Gambar 2). Gambar 1. Koloni bakteri Ralstonia solanacearum pada media TZCA : cembung, berlendir, berwarna putih dengan bagian tengah berwarna merah Gambar 2. Produksi pigmen fluorescent biru lemah (weak blue) oleh Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (kiri) dan hijau kuning kuat (strong greenyellow) oleh P. syringae. pv. syringae (kanan) pada umur 3 hari pada media King’s B Morfologi sel. Bakteri patogen tumbuhan umumnya gram negatif dengan bentuk batang. Namun adapula yang gram positif dengan bentuk filamen. Morfologi sel bakteri patogen tidak berbeda dengan bakteri non patogen sehingga dibutuhkan teknik lain untuk identifikasi bakteri patogen tumbuhan. Karakteriasi fisiologi. Beberapa uji fisiologi yang dilakukan adalah kemampuan tumbuh pada kisaran suhu tertentu (40 atau 37°C), suhu lethal (thermal death point) untuk patogen tumbuhan biasanya adalah 50-55ºC pada medium cair selama 10 menit, toleansi terhadap NaCl, resistensi terhadap antibiotik, misalnya streptomycin untuk Erwinia amylovora uji produksi toksin, ice nucleation activity untuk Pseudomonas syringae group and Clavibacter spp. Karakterisasi biokimia dapat menguji ekspresi genetik dari bakteri pada media uji, misalnya sumber C dan N, sifat oksidatif/fermentatif (OF), LOPAT, dan produksi enzim tertentu. Beberapa kit komersial telah tersedia untuk pengujian biokimia ini, misalnya API system strips dan BIOLOG system. Gambar 3. Uji OF untuk bakteri R. solanacearum (Rs) dan E. carotovora (E-1) : Warna kuning pada media tanpa parafin (b dan d) menunjukkan kedua bakteri bersifat oksidatif. Warna kuning pada media dengan parafin (c) menunjukkan bakteri bersifat fermentatif, sedangkan media akan tetap berwarna hijau (a) menunjukkan bakteri tidak bersifat fermentatif Identifikasi secara genotipik tekniknya sama dengan deteksi dengan molekuler, yaitu menggunakan PCR seperti rep-PCR, BOX PCR, Nested PCR, RFLP, RAPD, AFLP, dsb. Masing-masing teknik PCR ini memiliki kespesifikan tersendiri. Untuk identifikasi yang lebih akurat dapat digunakan primer spesifik dan perunutan DNA (DNA sequencing).

Semakin miripan sekuen DNA berarti semakin dekat hubungan kekerabatannya (tingkat keakuratan identifikasi). Keunggulan identifikasi dengan teknik molekuler adalah : · ·

Cepat, sensitif dan relatif lebih murah (cost effective) Tersedia kit komersial dan terstandar

· Dapat digunakan untuk bakteri yang tidak dapat dikulturkan maupun yang dapat dikulturkan ·

Dapat lebih mudah menelusuri GMO di lapangan

·

Tingkat diskriminatifnya tinggi, bisa sampai strai

Kelemahannya adalah : ·

Spesifisitas dan sensitivitas tidak dapat diketahui atau terbatas

·

Dapat terjadi hasil negatif karena gangguan faktor lingkungan atau biokimia

· Tidak dapat membedakan sel yang mati dan yang hidup serta adanya cemaran asam nukleat di dalam sampel · Dapat terjadi kesalahan diagnosis (negatif atau positif palsu) yang sulit diverifikasi. Postulat Koch tidak terpenuhi. · Perubahan probe/primer/enzim/metode/bahan-bahan kimia yang digunakan dapat menyebabkan perbedaan hasil. ·

Hasilnya tergantung pada informasi sistem identifikasi yang sudah tersedia di bank data

http://kusumadarma17.blogspot.com/2011/07/teknik-identifikasi-bakteri.html Identifikasi bakteri dilakukan berdasarkan hasil pengujian dari uji morfologi dan uji biokimia. Identifikasi menggunakan buku Bergey’s Manual of Systematic Bacteoriology dan Tabel identifikasi bakteri Gram-negatif. Uji morfologi dilakukan dengan pewarnaan Gram dari setiap koloni terduga. Pewarnaan Gram bertujuan untuk melihat bentuk atau morfologi dan sifat pewarnaan dari mikroorganisme tersebut. Uji biokimia dilakukan dengan menginokulasi biakan pada media TSIA ke dalam media: Citrat, Na, trypton (indol), MR (methyl red) dan VP (voger proskauer). Tujuan dari uji utilasi sitrat adalah untuk mengetahui jenis bakteri yang mengutilisisasi sitrat. Bakteriyang memanfaatkan sitrat sebagai sumber karbon akan menghasilkan natrium karbonat yang bersifat alkali, sehingga dengan adanya indikator brom thymol blue menyebabkan warna biru pada media.

Tujuan uji motilitas untuk mengetahui bakteri yang dites bergerak atau tidak. Pergerakan bakteri dapat dilihatdengan adanya kekeruhan disekitar tusukan pada media karena medium dalam keadaan semisolid. Uji indol bertujuan untuk mendeteksi kemampuan mikroba mendegradasikan asam aminotryptophan. Pembentukan indol dari mikroorgamisme dapat diketahui dengan menumbuhkannya dalam media biakan yang kaya akan triptofan. Untuk melihat adanya indol digunakan reagen kovac yang memberikan reaksi warna apabila tes positif. Uji Voges Proskauer bertujuan untuk mendeteksi adanya acethyl methyl carbinol yang diproduksi oleh bakteri tertentu dalam pembenihan VP. Adanya bekteri tertentu yang dapat memproduksi acethyl methylcarbinol dapat diketahui dengan penambahan reagen voges prouskauer (reagen VP). Uji Methyl Red bertujuan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran. Beberapa bakteri memfermentasikan glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersifat asam sehinggaakan menurunkan pH media pertumbuhan menjadi 5,0 atau lebih rendah. Penambah indikator pH “methyl red” dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam. http://rinapratiwi20.blogspot.com/2017/02/cara-identifikasi-bakteri.html Identifikasi mikroba adalah suatu proses yang bertujuan untuk mengetahui bentuk, sifatsifat maupun morfologi dari sauatu mikroba atau dengan kata lain untuk memperlihatkan bagian-bagian sel mikroba.Identifikasi mikroba dapat dilakukan dengan metode pewarnaan gram. Metode pewarnaan gram adalahsuatu teknik atau metode pewarnaan yang paling luas digunakan untuk identifikasi bakteri. Metode ini merupakan metode pewarnaan diferensial yang menggunakan lebih dari satu zat warna. Metode Pewarnaan gram adalah salah satu metode yang bertujuan untuk mengidentfikiasi mikroba berdasarkan kemampuannya dalam menyerap zat warna. Metode ini merupakan salah satu teknik pewarnaan yang paling sering digunakan dalam mengidentifikasi bakteri. Pada metode ini, olesan bakteri yang telah difiksasi dikenai larutan-larutan zat warna seperti kristal violet, larutan yodium, larutan akohol, dan zat pewarnaan tandinganya berupa zat warna safranin atau air fucshin. Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini terbagi menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram positf dan bakteri gram negatif. Pada bakteri garam positif, bakteri akan mempertahankan zat warna kristal violet karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Sedangkan bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan akan mengikat zat pewarna tandingnya yaitu safranin dan akan tampak berwarna merah pada pengamatan dengan mikroskop, dimana perbedaan pengikatan zat warna ini di sebabkan oleh perbedaan komponen penyusun dinding selnya. Bakteri Gram Postif dan Negatif

Sumber : http://laboratoryinfo.com Berikut akan dijelaskan lebih lanjut mengenai bakteri gram postif dan negatif termasuk struktur dinding sel, ciri-ciri beserta contohnya masing-masing : Bakteri gram positif adalah bakteri yang dinding selnya mengandung banyak peptidoglikan dan kandungan lipidnya rendah sekitar 1-4%. Alkohol dapat melunturkan lipid pada dinding sel bakteri, sehingga saat pencucian dengan alkohol, pada bakteri gram positif tidak terlalu banyak lipid yang luntur dari dinding selnya sehingga pori-pori yag terbentuk tidak terlalu banyak dan bakteri dapat mengikat zat warna utama (kristal violet) yang akan membentuk ikatan mg-Ribonucleid acid pada membran/dinding sel bakteri dan membentuk kompleks mg-Ribonucleid acid- crystal violet yang tidak luntur dengan alkohol. Bakteri gram positif memiliki ciri-ciri diantaranya struktur dinding selnya yang tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer, mengandung lipid dalam jumlah yang sedikit, mengandung asam tekoat, rentan terhadap penisilin, komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit dan lebih resisten terhadap gangguan fisik dari pada bakteri gram negatif, serta dapat membentuk toksin yaitu eksotoksindan endotoksin. Contoh bakteri gram positif ialah Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, dan Clostridium perfringens. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang dinding selnya tidak mengandung banyak peptidoglikan namun kandungan lipidnya tinggi sekitar 11-22%. Pada saat pencucian dengan alkohol lipid dapat dilunturkan dari dinding sel bakteri membentuk pori-pori yang besar sehingga bakteri tidak dapat mempertahankan zat warna utama tapi akan mengikat warna pada saat penambahan zat warna sekunder (safranin) dan tampak berwarna merah pada mikroskop. Bakteri gram negatif memiliki ciri-ciri diantaranya struktur dinding selnya yang tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.mengandung lemak dalam jumlah yang banyak, tidak mengandung asam tekoat, kurang rentan terhadap senyawa penisilin, komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana, tidak resisten terhadap gangguan fisik, dan dapat membentuk toksin yaitu endotoksin. Contoh bakteri gram negatif ialah Escherichia coli,Rhizobium leguminosarum, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, dan Helicobacter pylori. Jenis-jenis Larutan dalam Pewarnaan Gram Berikut akan dijelaskan mengenai jenis-jenis larutan yang digunakan dalam pewarnaan gram lengkap dengan fungsinya masing-masing, selamat membaca : 1.

Kristal Violet

Sumber : https://www.homesciencetools.com Pertama ada kristal violet yang berfungsi sebagai zat warna utama. Zat warna ini bekerja dengan cara membentuk ikatan mg-Ribonucleid acid pada membran atau dinding sel bakteri sehingga membentuk kompleks mg-Ribonucleid acid-crystal violet pada bakteri gram positif. Kompleks mg-Ribonucleid acid-crystal violet merupakan senyawa yang tidak luntur meskipun telah dibilas dengan alkohol, oleh karena itu zat warna ini dapat digunakan untuk membedakan bakteri gram positif dan negatif. 2.

Iodin

Sumber : http://www.sihatselalu.com.my Pada pewarnaan gram iodin berfungsi sebagai penstabil (stabilizer) dan penguat ikatan zat warna oleh bakteri. Iodin bekerja dengan cara memperkuat ikatan pada kompleks mgRibonucleid acid sehingga zat warna utama dapat membentuk kristal violet yang besar dalam lapisan peptidoglikan dinding bakteri. Dalam hal ini, apabila bakteri yang dicobakan merupakan bakteri gram negatif yang memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis, maka kristal violet tersebut hanya akan menempel pada membran lipid. Sedangkan jika bakteri yang dicobakan merupakan bakteri gram positif maka kristal violet akan tertanam lebih dalam karena peptidoglikannya yang tebal. 3. Alkohol

Sumber : Data Primer Mikrobiologi Umum 2017 Pada pewarnaan gram alkohol berfungsi untuk membilas atau melunturkan zat warna pada bakteri. Alkohol bekerja dengan cara melarutkan lapisan lipid pada dinding sel bakteri sehingga dapat melunturkan zat warna kristal violet dari dinding sel khususnya pada bakteri gram negatif. Karena pemberian alkohol menyebabkan lunturnya warna ungu dari dinding sel bakteri gram negatif maka bakteri menjadi tidak berwarna lagi. Sedangkan, pada bakteri gram positif pemberian alkohol tidak berpengaruh banyak karena kristal violet telah tertanam pada lapisan peptidoglikannya yang tebal sehingga tidak mudah luntur. 4.

Safranin

Sumber : http://www.polysciences.com Safranin merupakan zat warna tandingan atau pewarna skunder yang digunakan dalam metode pewarnaan gram. Safranin bekerja dengan cara mewarnai sel-sel bakteri yang telah kehilangan warna utama setelah luruh nya kompleks mg-Ribonucleid acid-crystal violet dari dinding sel bakteri gram negatif akibat penambahan alkohol, safranin dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat mennyebabkan sel bakteri kembali berwarna namun dengan warna yang berbeda yaitu merah. 5.

Aquades

Sumber : https://www.sanismart.de Aquades berfungsi untuk membilas sisa-sisa zat warna yang tidak diikat dinding sel bakteri pada proses pewarnaan gram,sehingga tidak ada zat warna yang tersisa pada kaca perparat selain yang terikat oleh dinding sel, sisa-sisa zat warna pada kaca preparat penting untuk dibersihkan agar tidak mengganggu hasil identifikasi pada saat pengamatan di mikroskop. Aquades bekerja dengan cara mengikat zat warna yang tersisa pada kaca preparat dan ikut mengalirkan sisa zat tesebut bersama dengan aquades pada saat pembilasan. DAFTAR PUSTAKA Hafsan, dkk. 2015. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Makassar : Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar. Pelczar, M. J. 2007. Dasar - Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press. Setyaningsih, M. dan Susilo. 2015. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Universitas Muhammadiyah Jakarta. http://foryourmicrobionotes.blogspot.com/2017/05/normal-0-false-false-false-in-x-nonex.html