Bahan Lo 1.docx

Pengertian Teknologi DNA Rekombinan Teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Manfaat Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.

DNA Rekombinan, merupakan kumpulan teknik atau metode yang digunakan untuk mengkombinasikan gengen secara buatan.Teknologi DNA Rekombinan ini meliputi : 1. Teknik mengisolasi DNA 2. Teknik untuk memotong DNA 3. Teknik untuk menyambung atau menggabung DNA 4. Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat di ekspresikan. Perangkat Utama yang digunakan dalam DNA rekombinan adalah : a. Plasmid b. Enzim Restriksi c. DNA Ligase d. Bakteri Isolasi DNA Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. P rotein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl (lihat Bab II).

Enzim Restriksi Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid. Ligasi Molekul – molekul DNA

Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T 4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Jika cara yang pertama hanya dapat digunakan untuk meligasi ujungujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase. Transformasi Sel Inang Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan teknik elektroforesis Seleksi Transforman dan Seleksi Rekombinan (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR). Hubungan DNA, RNA, dan protein. Fungsi utama dari DNA adalah sebagai pengatur aktivitas sel namun DNA tidak melakukannya secara langsung. DNA mentrankripsikan dirinya menjadi RNA. RNA inilah yang berperan secara langsung dalam pembentukan protein, RNA di dalam ribosom melewati proses translasi, suatu proses penerjemahan kodon pada RNAr oleh RNAt, yang akan menghasilkan susunan asam amino pembentuk protein. Protein ini dapat berfungsi sebagai protein struktural, fungsional, maupun pengatur. DNA adalah komponen dari kehidupan, agar dapat berfungsi maksimal maka DNA harus disalin secara akurat dan ditransmisikan ke sel anak, dan informasi dalam DNA harus diekspresikan. Jika terjadi kesalahan dalam proses replikasi, transkripsi, ataupun translasi dapat menyebabkan kesalahan pada protein yang seharusnya dibentuk dan hal ini akan membuat suatu abnormalitas pada penderitanya. Metabolisme sel Fase pada siklus sel •

Fasa S (sintesis): Tahap terjadinya replikasi DNA

•

Fasa M (mitosis): Tahap terjadinya pembelahan sel (baik pembelahan biner atau pembentukan tunas)

•

Fasa G (gap): Tahap pertumbuhan bagi sel. •

Fasa G0, sel yang baru saja mengalami pembelahan berada dalam keadaan diam atau sel tidak melakukan pertumbuhan maupun perkembangan. Kondisi ini sangat bergantung pada sinyal atau rangsangan baik dari luar atau dalam sel. Umum terjadi dan beberapa tidak melanjutkan pertumbuhan (dorman) dan mati.

•

Fasa G1, sel eukariot mendapatkan sinyal untuk tumbuh, antara sitokinesis dan sintesis.

•

Fasa G2, pertumbuhan sel eukariot antara sintesis dan mitosis.

•

Fasa tersebut berlangsung dengan urutan S > G2 > M > G0 > G1 > kembali ke S. Dalam konteks Mitosis, fase G dan S disebut sebagai Interfase.

Diferensiasi sel •

Regenerasi sel adalah proses pertumbuhan dan perkembangan sel yang bertujuan untuk mengisi ruang tertentu pada jaringan atau memperbaiki bagian yang rusak.

•

Diferensiasi sel adalah proses pematangan suatu sel menjadi sel yang spesifik dan fungsional, terletak pada posisi tertentu di dalam jaringan, dan mendukung fisiologis hewan. Misalnya, sebuah stem cell mampu berdiferensiasi menjadi sel kulit.

•

Saat sebuah sel tunggal, yaitu sel yang telah dibuahi, mengalami pembelahan berulang kali dan menghasilkan pola akhir dengan keakuratan dan kompleksitas yang spektakuler, sel itu telah mengalami regenerasi dan diferensiasi.

•

Regenerasi dan diferensiasi sel hewan ditentukan oleh genom. Genom yang identik terdapat pada setiap sel, namun mengekspresikan set gen yang berbeda, bergantung pada jumlah gen yang diekspresikan. Misalnya, pada sel retina mata, tentu gen penyandi karakteristik penangkap cahaya terdapat dalam jumlah yang jauh lebih banyak daripada ekspresi gen indera lainnya.

Tahapan Sintesis Protein •

Sintesis protein secara garis besar dibagi menjadi dua tahapan utama, yaitu proses pembuatan molekul mRNA pada inti sel (transkripsi) dan proses penerjemahan mRNA oleh rRNA serta perangkaian asam amino di ribosom (translasi).

1. Transkripsi •

• • •

• •

Transkripsi terjadi di inti sel. Pada tahapa ini, RNA polimerase akan melekat pada rantai DNA sehingga rantai membuka. Salah satu rantai DNA yang akan diterjemahkan (DNA template/rantai sense) mulai mendapatkan basa pasangannya, sehingga tercipta rantai komplemen. Rantai komplemen inilah yang kemudian akan menjadi mRNA (messenger RNA). Note: pada proses pembuatan mRNA, kode A pada rantai sense akan berkomplemen dengan kode U (urasil), bukan T atau timin seperti pada DNA. RNA polimerase selanjutnya akan bergerak sepenjang rantai DNA hingga kode-kode yang diperlukan selesai diterjemahkan menjadi mRNA primer. Peristiwa ini hanya terjadi pada rantai sense atau DNA template saja, sedangkan pada rantai antisense atau DNA non-template tidak akan terjadi. Setelah selesai, mRNA primer akan dilepaskan dan selanjutnya akan melalui beberapa proses. a. capping dan polyadenilasi b. intron dihilangkan dan ekson akan bergabung splicing c. splicing akan berlanjut hingga terbentuk mRNA siap pakai. Note: mRNA terdiri dari dua macam kode, yaitu ekson dan intron. Ekson adalah kode yang dipakai, sedangkan intron akan dibuang. mRNA matang selanjutnya akan ditransfer ke sitoplasma untuk menuju tahapan selanjutnya, yaitu translasi di ribosom.

2. Translasi • •

Tahapan translasi merupakan tahapan dimana mRNA matang dari dalam inti sel yang telah ditransfer ke sitoplasma, tepatnya diribosom, segera diterjemahkan. Translasi sendiri terdiri dari tiga tahapan, yaitu inisiasi, elongasi dan terminasi.

a. Inisiasi

•

•

Pada saat mRNA sampai di ribosom, proses pertama kali yang terjadi adalah inisiasi. Yaitu proses pengenalan kodon (pasangan 3 kode: cth. UAA, AUG), yang dimana sintesis akan dimulai dari kodon pemula (kodon start) yang merupakan asam amino Metionin, dengan kode AUG. Setelah kodon ini terbaca, asam amino pertama akan berada diribosom untuk selanjutnya digabungkan dengan asam amino selanjutnya. Asam amino berada bebas disitoplasma dan dibawa menuju ribosom oleh RNA transfer atau tRNA.

b. Elongasi •

•

•

Elongasi merupakan proses kelanjutan dari inisiasi. Pada tahapan ini, kodon akan terus dibaca dan tRNA akan terus menerus membawa asam amino ke ribosom sesuai dengan kodon yang ada pada mRNA. Pada proses elongasi, ribosom biasanya akan berada pada posisi agregat atau kumpulan. Dua atau lebih ribosom akan melekat pada rantai mRNA secara bersama-sama sehingga terlihat seperti sedang bergerombol. Fenomena ribosom yang berkelompok ini disebut dengan polisom dan fungsinya adalah mempercepat proses sintesis protein.

c. Terminasi •

•

•

Terminasi merupakan proses terakhir dari translasi. Proses ini mulai terjadi ketika kodon yang terbaca adalah kodon-kodon yang mengkode berhentinya sintesis protein. Kodon ini dinamakan dengan kodon stop, yang terdiri dari tiga kodon yaitu UAA, UAG, dan UGA. Ketika salah satu kodon-kodon tersebut terbaca, faktor pelepas akan memberhentikan proses sintesis rantai asam amino. Proses terminasi diakhiri dengan terbentuknya rantai asam amino yang sangat panjang, atau lebih sering dinamakan dengan rantai polipeptida. Penamaan ini didasarkan pada ikatan antara satu asam amino dengan asam amino lainnya yang dinamakan dengan ikatan peptida. Rantai polipeptida inilah yang kita sebut dengan protein, lebih tepatnya protein primer. Protein atau rantai polipeptida dari hasil sintesis protein merupakan rantai protein primer. Protein ini harus mengalami modifikasi agar bisa digunakan dalam tubuh. Proses modifikasi akan dilakukan dibadan golgi setelah ditransfer dari retikulum endoplasma.

Referensi: •

Hickman, et all. 2001. Integrated principles of zoology, 11 th ed. McGraw-Hill Companies, Inc.: New York.