Bab Ii Inokulasi.docx

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1.

Teknik Pembiakan Pembiakan merupakan proses perbanyakan organisme melalui penyediaan

kondisi lingkungan yang sesuai. Pembiakan dapat juga didefinisikan ketika suatu mikroorganisme yang sedang tumbuh membuat replikanya sehingga jumlahnya semakin banyak. Mikroorganisme dalam hal ini membutuhkan adanya elemenelemen dalam komposisi kimia mereka selama pembiakan berlangsung. Nutrisi harus menyediakan elemen ini dalam bentuk yang mudah dimetabolisme. Faktor yang harus dikontrol selama pertumbuhan mikroorganisme itu meliputi nutrisi, pH, temperature, aerasi, konsentrasi garam dan kekuatan ionik medium. Teknik pembiakan dilakukan berdasarkan tujuan melakukan pembiakan mikroorganisme. Umumnya tiga situasi dapat ditemukan yaitu memperbanyak atau menumbuhkan spesies tertentu, menentukan jumlah dan tipe organisme yang ada pada sample, mengisolasi organisme tertentu dari sumber alami. Media yang mengandung bahan disertai dengan kondisi yang telah sesuai dan ditentukan guna memperbanyak spesies tertentu harus disiapkan untuk pertumbuhan spesies tersebut. Suatu jenis media yang bersifat selektif dan kaya nutrient dibutuhkan untuk hal ini sehingga pertumbuhan mikroorganisme akan berjalan baik. Bakteri sebagai suatu mikroorganisme pada umumnya hanya mengenai satu macam pembiakan saja, yaitu pembiakan secara aseksual atau vegetatif. Pembiakan ini berlangsung dengan cepat jika faktor-faktor luar menguntungkan. Pembelahan diri bakteri dapat dibagi atas 3 fase. Fase pertama adalah fase diantara sitoplasma terbelah oleh sekat yang tumbuh tegak lurus pada arah memanjang, sekat tersebut diikuti oleh suatu dinding melintang ini tidak selalu merupakan penyekat yang sempurna, ditengah-tengah sering ketinggalan suatu lubang kecil, dimana protoplasma kedua sel baru masih tetap berhubung. Hubungan-hubungan antara protoplasma disebut plasmadesmida. Fase terakhir ialah berpisah, yaitu yang satu terlepas sama sekali daripada yang lain setelah dinding melintang menyekat secara sempurna. Bakteri yang semacam ini

merupakan koloni yang merata, jika dipiara pada medium padat. Bakteri-bakteri yang dindingnya lebih kokoh itu tetap bergandeng-gandengan setelah pembelahan bakteri macam ini merupakan koloni yang kasar permukaannya. Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH yang tepat. Kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang terlalu basa, kecuali Vibrio cholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu juga merupakan variabel yang perlu dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu mesofil, suhu optimum untuk pertumbuhannya 20-40oC (Volk, 1993). PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam pembuatan medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu asam tidak cocok untuk dijadikan medium mikroba karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut. Medium didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa medium masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan medium yang steril juga menentukan. Memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di dalamnya harus memperhatikan berbagi macam ketentuan seperti jika yang ingin kita membuat medium untuk organisme bersel tunggal, biasanya air sangat penting sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan medium agar padat, digunakan agar-agar, gelatin atau gel silika. Bahan agar yang utama adalah galaktan (komplek karbohidrat yang diekstrak dari alga genus Gelidium). Agar akan larut atau cair pada suhu hampir 100oC dan akan cair apabila kurang lebih 43oC (Hadioetomo, 1993). 2.2.

Inokulasi Bakteri Penanaman bakteri atau disebut juga inokulasi bakteri adalah proses

pemindahan suatu biakan bakteri dari suatu tempat berupa tabung reaksi ke tempat lain dengan tujuan untuk mengembangbiakkan. Pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru harus dilakukan dengan tingkat ketelitian dan kesterilan yang sangat tinggi. Hal utama yang harus diperhatikan untuk melakukan inokulasi bakteri adalah agar semua alat yang ada

dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril. Kesterilan ini bertujuan untuk enghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1998). Prinsip dari isolasi bakteri adalah memisahkan satu jenis bakteri dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam bakteri. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel bakteri akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya (Nur, I. dan Asnani, 2007). Teknik yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme pada media agar memungkinkannya tumbuh dengan agak berjauhan dari sesamanya, juga memungkinkan setiap selnya berhimpun membentuk koloni, yaitu sekelompok massa sel yang masih dapat dilihat dengan mata tanpa alat pembantu. Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum, dengan menginokulasi medium agar nutrien atau nutrien agar dengan metode agar tuang atau media agar sebar, sel-sel mikroorganisme akan terpisah sendiri-sendiri. Setelah inkubasi, sel-sel mikroba individu memperbanyak diri secara cepat sehingga dalam waktu 18 sampai 24 jam terbentuklah massa sel yang dapat dilihat dan dinamakan koloni. Koloni dapat terlihat oleh mata telanjang. Setiap koloni merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme (Pelczar dan Chan, 2007). Suatu jenis koloni bakteri yang terpisah dari koloni campurannya akan lebih mudah untuk diamati. Teknik untuk memisahkan dan mendapatkan koloni tunggal serta pemeliharannya terdapat beberapa jenis. Teknik-teknik pemisahan tersebut memiliki kelebihan dan kelemahan. Beberapa cara dapat dilakukan untuk menentukan jumlah bakteri yang terdapat pada bahan pemeriksaan. Cara yang paling sering digunakan dalam penghitungan koloni adalah cara penghitungan koloni pada lempeng pembiakan (plate count) atau dapat dilakukan penghitungan secara langsung yaitu secara mikroskopis (Burrows, 2004). Kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh dan tetap hidup merupakan suatu hal yang penting untuk diketahui. Pengetahuan tentang adanya faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba sangat penting di dalam mengendalikan pertumbuhan mikroba. Faktor penting yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba meliputi suplai energi, suhu atau temperatur, keasaman atau kebasaan yang dinyatakan dengan pH, serta ketersediaan oksigen (Suriawiria, 2005).

Ruangan tempat inokulasi bakteri harus disiapkan dan dipastikan bersih serta dalam keadaan yang steril sebelum melakukan inokulasi. Tujuan sterilisasi agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan di labotarium pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah kotak kaca atau encast, dimana udara dilewatkan dalam saringan melalui suatu jalan dengan tujuan agar terkena sinar ultraviolet (Pelczar, 1986). Pemindahan dengan pipet dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk diambil 1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni. Pemindahan dengan kawat inokulasi dilakukan dengan ujung kawat inokulasi dari platina atau nikel. Ujung dari kawat bisa lurus atau berupa kolongan yang diameternya 1-3 mm. Kawat terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya berupa tungkai cukup dilewatkan nyala api saja, kemudian setelah dingin kawat itu disentuhkan kembali ke dalam nyala (Pelczar, 1986) 2.3.

Inkubasi Bakteri Inkubasi merupakan suatu teknik perlakuan bagi mikroorganisme, dalam

hal ini bakteri, yang telah diinokulasikan pada media (padat atau cair), kemudian di simpan pada suhu tertentu untuk dapat melihat bagaimana pertumbuhannya. mikroorganisme tidak dapat tumbuh dengan baik bila suhu inkubasi tidak sesuai dengan yang diperlukan. Media inkubasi pada umumnya digolongkan menjadi 2 jenis, yaitu pada lemari biasa atau suhu kamar, dan pada incubator yang suhunya dapat di tentukan. Proses ini bertujuan agar kita dapat melihat pertumbuhan atau perkembangbiakan pada mikroorganisme. Inkubasi dapat difenisikan sebagai proses memelihara kultur mikroba dalam suhu tertentu selama jangka waktu tertentu guna memantau pertumbuhan yang terjadi pada bakteri. 2.3.1. Media yang Digunakan Pada Inkubasi Mikroba Media inkubasi digolongkan menjadi dua, yaitu pada lemari biasa, atau suhu kamar dan pada inkubator yang suhunya dapat di tentukan. Inkubator adalah alat dengan suhu atau kelembaban tertentu yang digunakan untuk menginkubasi atau memeram mikroba. Kisaran suhu untuk inkubator produksi Heraeus B5042 misalnya adalah 10-70oC. Suhu di dalam inkubator adalah konstan dan dapat diatur sesuai dengan tujuan dilakunnya inkubasi. Inkubator di dalam laboratorium

mikrobiologi digunakan untuk menumbuhkan bakteri pada suhu tertentu, menumbuhkan ragi dan jamur, menyimpan biakan murni mikroorganisme pada suhu rendah. Ciri dari inkubator adalah memiliki sekat untuk menumbuh kembangkan mikroba, terdapat sekat kaca pada pintunya yang berfungsi untuk mempermudah melihat mikroba yang sedang diinkubasi tanpa membuka dan menutup bagian dalam dari inkubator sehingga suhunya tetap terjaga. 2.3.2. Permasalahan yang Umum Terjadi pada Inkubasi Inkubasi merupakan suatu teknik perlakuan bagi mikroorganisme setelah inokulasi dengan tujuan agar dapat melihat pertumbuhannya atau disebut juga proses memelihara kultur mikroba dalam suhu tertentu selama jangka waktu tertentu guna memantau pertumbuhan yang terjadi pada bakteri. Sebagai suatu proses, pasti akan selalu terdapat permasalahan yang yang umumnya apabila terjadi pada inkubasi maka akan menghambat bahkan dapat membuat hasil yang diinginkan tidak tercapai. Permasalahan yang umum terjadi tersebut antara lain: 1) Pertumbuhan spreader atau koloni yang melebar 2) TNTC (Too Numerous To Count) 3) Terdapat gelembung pada kertas membran 4) Membran terangkat dan terlipat 5) Koloni tersebar tidak merata (terkumpul di pinggir atau disuatu tempat) 6) Pertumbuhan di luar bekas corong dan bekas pinset 7) Inkubasi terlalu lama 2.4.

Medium Inokulasi Media yang digunakan dalam inokulasi terdiri dari beberapa macam, yaitu

piaraan campuran (mixed culture), piaraan lempengan (plate culture), piaraan miring (slant culture), piaraan tusuk (stab culture), piaraan cairan (liquid culture), dan piaraan adukan (shake culture). Mixed culture adalah media piaraan campuran yang berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme. Plate culture adalah piaraan lempengan yang merupakan media padat dalam cawan petri, dimana piaraan diperoleh dengan menggesek ujung kawat inokulasi yang membawa jamur pada permukaan agar-agar lempengan dalam cawan petri hingga nantinya meliputi seluruh permukaan. Slant culture adalah media padat dalam tabung reaksi. Piaraan

diperoleh dengan cara menusukkan ujung kawat inokulasi yang membawa jamur dalam agar-agar pada tabung reaksi sedangkan permukaan agar ini tidak miring. Liquid culture adalah piaraan cairan merupakan media cair yang ditampung di dalam tabung reaksi. Shake culture merupakan media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya dikocok. Biakan yang ada dapat diperoleh dengan cara mencampuradukkan setetes suspensi jamur ke dalam medium yang masih cair dan belum membeku, sehingga jamur dapat tinggal di dalam media. 2.5.

Biakan Murni Suatu biakan atau piaraan murni yang telah disimpan selama bertahun-

tahun mudah sekali mengalami mutasi, dan jika hal ini terjadi, maka piaraan ini bukan lagi biakan atau piaraan yang murni karena telah kehilangan tipe aslinya. Hal yang dapat dilakukan untuk menghindari atau mengurangi terjadinya mutasi pada biakan atau piaraan murni tersebut adalah sebagai berikut: 1)

Pada waktu-waktu tertentu biakan dipindahkan ke medium yang baru.

2)

Biakan disimpan di dalam tempat yang bersuhu rendah

3)

Biakan disimpan di tempat yang terhindar dari radiasi. Bakteri juga harus diliofilisasikan, yaitu dimasukkan dalam ampul berisi

suhu kering bercampur dengan karbondioksida, kemudian disimpan di tempat yang dingin. Beberapa biakan sewaktu-waktu perlu diremajakan setiap dua atau tiga bulan sekali. Cara meremajakannya adaah piaraan perlu dipindahkan ke medium baru pada suhu biasa yaitu antara 25-27oC yang kemudian dimasukkan dalam lemari es untuk diperbarui dua atau tiga bulan lagi, sedangkan untuk penyimpanan dengan cara diliofilisasikan asal selalu ada dalam 4oC. Dilihat dari keadaan sebenarnya yang terjadi di alam bebas, boleh dikatakan bahwa tidak ada bakteri yang dapat hidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Dikenal beberapa cara untuk menyendirikan suatu spesies, pertama adalah dengan pengenceran, yaitu suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam spesies diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Enceran tersebut kemudian diambil sebanyak 1 ml untuk dincerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil sebanyak 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu koloni tumbuh dalam medium tersebut, mungkin juga hanya diperoleh

satu koloni saja, maka dalam hal yang demikian ini diperoleh satu koloni murni. Pengenceran dapat diulangi kembali jika koloni tunggal yang diperoleh belum murni, yaitu dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel. Robert koch (1943-1905) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan. Sampel yang sudah diencerkan kemudian disebarluaskan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Hasil yang diperoleh berupa suatu piaraan adukan. Selang beberapa jam kemudian setelah medium itu mengental, akan tampk koloni yang masingmasing dapat dianggap sebagai biakan murni. Biakan murni yang lebih terjamin akan diperoleh dengan mengulang pekerjaan seperti diatas. Metode yang sekarang banyak digunakan adalah metode penggesekan, karena metode ini tidak begitu memakan waktu, namun kekurangannya adalah dengan cara ini bakteri anaerob tidak dapat tumbuh. Ujung kawat inokulasi ketika dibengkokan dan kemudian ujung kawat inokulasi itu setelah disentuhkan suatu koloni lalu digesekkan pada permukaan medium padat, maka beberapa waktu kemudian akan tampaklah koloni-koloni yang letaknya tersebar di permukaan medium. Waktunya berkisar kurang dari 12 jam. Suatu piaraan akan diperoleh murni jika diadakan pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil. Mikropipet merupakan alat yang dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak bakteri yang ada, dengan ketidakikutsertan dari bakteri lain. Mikropipet ditempatkan pada tangan-tangan suatu mikromanipulator, dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kaca penutup. Pekerjaan ini dilakuan di bawah obyektif mikroskop. Suatu tetesan yang nampaknya hanya mengandung satu bakteri, maka tetesan tersebut dipindahkan dengan mikropipet ke medium encer dengan tujuan utama agar bakteri tersebut berkembang biak terlebih dahulu, yang selanjutnya akan diperoleh piaraan murni. Metode ini sangat memerlukan kesabaran dan harga mikromanipulator yang sangat mahal. Tidak semua bakteri dapat tumbuh di dalam tubuh seekor hewan. Misalnya apabila dambil dahak dari seseorang yang disangka menderita TBC, maka ketika dahak ini disuntikkan ke dalam tubuh tikus putih, bakteri-bakteri saproba yang ikut serta itu tidak akan bertahan, sehingga kemudian kita peroleh

semata-mata hasil TBC saja. Piaraan pneumococcus murni dapat diperoleh dengan jalan demikian juga. Bakteri yang ketinggalan dalam tubuh tikus yang sakit atau mati akhirnya dapat dipindahkan ke dlam medium yang sesuai. Hal tersebutlah yang mendasari metode dengan hewan. Inokulasi dapat dilakukan di dalam kulit (intracutaneous), di bawah kulit (subcutaneous), di dalam otot (intramuscular), atau juga dapat dilakukan di rongga tubuh atau lain-lain tempat lagi. 2.6.

Nutrient Agar Nutrient agar didefinisikan sebagai suatu medium yang berbentuk padat,

yang merupakan perpaduan antara bahan alamiah dan senyawa-senyawa kimia. Nutrient Agar dibuat dari campuran ekstrak daging dan peptone dengan menggunakan agar sebagai pemadatnya. Agar digunakan sebagai pemadat dalam hal ini, karena sifatnya yang mudah membeku dan mengandung karbohidrat yang berupa galaktam sehingga tidak mudah diuraikan oleh mikroorganisme. Ekstrak beef dan pepton dalam hal ini digunakan sebagai bahan dasar karena merupakan sumber protein, nitrogen, vitamin serta karbohidrat yang sangat dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembang. Medium nutrient agar merupakan medium yang berwarna coklat muda yang memiliki konsistensi yang padat dimana medium ini berasal dari sintetik dan memiliki kegunaan sebagai medium untuk menumbuhkan bakteri (Harry, 2012). Medium nutrient agar masuk kedalam medium khusus karena dibuat sebagai tempat menumbuhkan mikroba yang sudah diketahui komposisi pembuatannya. Nutrient agar dibuat dengan komposisi agar – agar yang sudah dipadatkan sehingga nutrient agar juga bisa disebut dengan nutrient padat yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Peran agar-agar dalam hal ini hanyalah sebagai pengental, bukan sebagai zat makanan pada bakteri. Agar-agar tersebut dapat mudah menjadi padat apabila sudah mencapai pada suhu tertentu. Medium nutrient agar disebut sebagai salah satu jenis medium padat yang memiliki komposisi agar-agar yang telah di panaskan dan mencair dengan suhu 95oC. Agar–agar digunakan untuk membuat medium padat, supaya dapat larut dan menjadi padat pada suhu 45oC. Nutrient agar lebih bersifat umum sehingga mikroba banyak tumbuh pada media ini (Amelia et al, 2005).

2.6.

Media TSA TSA merupakan suatu media kultur universal dimana hampir semua jenis

bakteri bisa tumbuh pada media ini. Trypticase soy agar digunakan untuk medium pertumbuhan dengan tujuan mengamati morfologi koloni, mengembangkan kultur murni, dan pertumbuhan untuk tes biokimia. Media TSA juga biasa digunakan untuk penghitungan jumlah bakteri. Media TSA memiliki keunggulan yaitu dapat digunakan untuk menumbuhkan berbagai macam jenis bakteri bakteri, tetapi media ini memiliki kelemahan, yaitu harus menghitung terlebih dahulu. Media TSA (Tryptone Soya Agar) dapat dibuat dari TSA sebanyak empat puluh gram dilarutkan dalam satu liter aquades lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Media tersebut disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121⁰C selama 15 menit. Kemudian sebagian media dituang ke tabung reaksi yaitu media agar miring dan dalam cawan petri yaitu agar petri. Media setelah mengeras diinkubasi selama 24 jam pada suhu 36oC, untuk agar petri diinkubasi secara terbalik. Kegagalan dalam pembuatan media dapat disebabkan oleh faktor kelalaian atau kurang memadainya peralatan laboratorium yang digunakan, kesalahan menimbang berat bahan, kurangnya ketelitian saat mengerjakan, kurang sterilnya alat dan bahan yang digunakan sehingga dimungkinkan adanya kontaminasi. Media juga dikatakan gagal apabila media tidak dapat dijadikan tempat perkembangan bakteri, hal ini dapat diakibatkan dari komposisi pembuat media, bentuk media (pada media padat) dan lainnya. Komposisi pembuat media yang tidak sesuai mengakibatkan kurangnya nutrisi yang dibutuhkan bakteri pada media, sehingga bakteri tidak tumbuh. Bentuk media padat yang tidak datar mengakibatkan sulitnya bakteri untuk berkembang biak. 2.7.

Media TSB Mikroorganisme harus dibiakkan di laboratorium pada bahan nutrien yang

berperan penting untuk pertumbuhan dan perkembangbiakannya. Susunan bahan nutrien, baik bahan alami maupun sintetik/buatan, yang dipergunakan untuk pertumbuhan dan perkembangan bakteri. Media berfungsi untuk menumbuhkan bakteri, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah bakteri, dimana dalam proses pembuatannya harus

disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi. Macam nutrien yang digunakan tergantung dari macam bakteri yang dibiakkan. TSB atau trypticase soy broth adalah suatu media broth diperkaya tujuan umumnya untuk isolasi, dan penumbuhan bermacam mikroorganisme. Media ini banyak digunakan untuk isolasi bakteri dari specimen laboratorium dan akan mendukung pertumbuhan mayoritas bakteri patogen. Media TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang menyediakan asam aminodan substansi nitrogen lainnya yang membuatnya dapat menjadi suatu media bernutrisi untuk bermacam mikroorganisme. Dekstrosa adalah sumber energi dan natrium klorida untuk mempertahankan kesetimbangan osmotik mikroorganisme. Dikalium fosfat ditambahkan dan berperan sebagai buffer untuk mempertahankan pH. 2.8.

Media TCBS Media adalah suatu campuran bahan yang mengandung nutrisi untuk

pembiakkan atau pertumbuhan, mempertahankan, dan menyeleksi bakteri yang dibiakkan secara invintro atau di luar tubuh sehingga diketahui jenis bakterinya. Agar TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose) adalah medium selektif yang digunakan untuk isolasi spesies vibrio dari specimen berak (stool) yang mengaduk bakteri campuran. Agar TCBS juga membedakan produksi karakteristik koloni dari spesies vibrio. Vibrio spp tumbuh kerdil pada media yang dirancang untuk isolasi Salmonella dan Shigella dengan menghasilkan koloni tak berwarna pada MCA. Agar TCBS mengandung natrium sitrat, natrium tiosulfat, dan ox-gall, yaitu 10% larutan yang bersama-sama menghambat pertumbuhan beberapa bakteri gram-positif kokus dan gram negative batang yang normal dalam feses. Agar TCBS bersifat selektif dan diferensial. Hal ini sangat selektif untuk vibrio dan diferensial karena adanya sukrosa dan pewarna. Fermentasi sukrosa menghasilkan asam yang mengubah warna blue bromothymol atau biru timol. Dua pewarna media menghasilkan array kuning, hijau atau biru sehingga memungkinkan membedakan antara berbagai vibrio. Vibrio cholerae adalah agenpenyebab kolera dan spesies vibrio lainnya telah dikaitkan dengan gastroenteritis dan ekstraintestinal, terutama dari telinga, jaringan lunak, dan darah.