Bab 2 Inakulasi Mufa.docx

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1.

Macam-Macam Media Inokulasi Ada beberapa macam media yang dapat digunakan sebagai media

inokulasi, yaitu mixed culture, plate culture, slant culture, stap culture, liquid culture, dan shake culture. Mixed culture berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme. Plate culture merupakan media padat berada dalam petridish. Slant culture merupakan media padat berada dalam tabung reaksi. Stap culture adalah media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya dilakukan dengan cara penusukan. Liquid culture adalah media cair dalam tabung reaksi. Selanjutnya media inokulasi shake culture adalah media cair dalam tabung reaksi dimana penanaman inokula dilakukan dengan cara dikocok (shake) (Syahranti dkk, 2012) 2.2.

Teknik Aseptik Sebelum dilakukan proses kultur mikroorganisme, pertama kali harus

mempertimbangkan bagaimana agar tidak terjadi kontaminasi. Mikroorganisme ada dimana saja karena ukurannya yang sangat kecil. Mikroorganisme mudah lepas dalam udara dan permukaan. Oleh karena itu, medium kultur harus disterilisasikan secepatnya setelah dilakukan preparasi untuk pemindahan mikroorganisme siap dikontaminasikan. Pentingnya tindakan pencegahan sampai penanganan berikutnya medium kultur harus tetap steril. Materi lain yang akan kontak juga harus tetap terjaga kesterilannya. Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi hingga kultur manipulasi dan media kultur steril disebut teknik aseptik (Mansyur, 2006). Kontaminasi udara juga sering menjadi suatu masalah karena udara selalu kontak dengan partikel debu dan banyak komunitas mikroorganisme di dalamnya. Pada saat wadah dibuka maka segera ditangani agar tidak terkontaminasi dengan udara sekitar. Pemindahan aseptik pada kultur dari salah satu medium ke medium yang lain harus teliti dengan loop inokulasi atau jarum harus disterilkan oleh pembakaran pada nyala api. Pada pertumbuhan kultur dibutuhkan tempat yang mudah dipindahkan ke permukaan agar datar dimana pertumbuhan suatu koloni berasal dari pertumbuhan dan pembelahan sel tunggal (uniseluler).

3

4

2.2.

Kurva Sigmoid Pertumbuhan Bakteri Kurva pertumbuhan adalah kurva yang sering digunakan untuk

menggambarkan pertumbuhan mikroba dalam proses pembuatan inokulasi. Kurva ini menjelaskan mengenai fase hidup mikroba dimulai dari masuknya mikroba hingga habisnya nutrient yang digunakan sebagai bahan makanan mikroba. Mikroba yang telah dimasukan ke dalam media inokulasi akan menyesuaikan diri lalu tumbuh memperbanyak diri. Kurva menunjukan jumlah koloni mikroba dibandingkan dengan jumlah waktu. Kurva ini juga menunjukan konsumsi nutrient.

Gambar 2.1. Kurva Pertumbuhan Bakteri (sumber : Alex, 2013)

2.2.1.

Fase Lag Setelah inokulasi, terjadi peningkatan ukuran jumlah sel, mulai pada waktu

sel tidak atau sedikit mengalami metabolisme dan pembelahan. Fase ini, ditandai dengan peningkatan komponen makromolekul pada sel, aktivitas metabolik sel, dan kerentanan terhadap zat kimia dan faktor fisik. Fase lag merupakan suatu periode penyesuaian sel dengan lingkungan yang penting untuk penambahan metabolit pada kelompok sel, menuju tingkat yang setaraf dengan sintesis sel maksimum. 2.2.2.

Fase Log Fase dimana pembiakan bakteri berlangsung paling cepat. Jika ingin

mengadakan biakan yang cepat tumbuh, maka bakteri dalam fase ini baik sekali untuk dijadikan inokulum. Fase eksponensial adalah fase dimana bakteri melakukan pembelahan secara biner dengan jumlah kelipatan (eksponensial). Pada fase ini, terjadi lonjakan peningkatan jumlah biomassa sel, sehingga bisa diketahui seberapa besar terjadi pertumbuhan secara optimal biomassa sel (Noverita, 2009).

5

Pada fase eksponensial atau logaritmik, sel berada dalam keadaan pertumbuhan yang seimbang. Selama fase ini, masa dan volume sel meningkat oleh faktor yang sama dalam arti rata-rata komposisi sel dan konsentrasi relatif metabolit tetap konstan. Selama periode ini pertumbuhan seimbang, proses reproduksi/ membelah diri sel tinggi, dan kecepatan peningkatan dapat diekspresikan dengan fungsi eksponensial alami. Sel membelah dengan kecepatan konstan yang ditentukan oleh sifat intrinsik bakteri dan kondisi lingkungan. Dalam hal ini terdapat keragaman kecepatan pertumbuhan berbagai mikroorganisme yang berbeda. Waktu yang digunakan untuk Escherichia coli untuk membelah hingga dua kali jumlah koloni dalam kultur kaldu pada suhu 37oC, sekitar 20 menit, sedangkan pada sel mamalia akan membutuhkan waktu sekitar 10 jam pada temperatur yang sama untuk mencapai jumlah koloni mencapai dua kali lipat. 2.2.3.

Fase Stasioner Pada saat digunakan kondisi biakan yang rutin, akumulasi produk limbah,

kekurangan nutrien, perubahan pH, dan faktor lain yang tidak diketahui akan mendesak dan mengganggu biakan, mengakibatkan penurunan kecepatan pertumbuhan. Selama fase ini, jumlah sel yang hidup tetap konstan untuk periode yang berbeda, bergantung pada bakteri, tetapi akhirnya menuju periode penurunan populasi. Dalam beberapa kasus, sel yang terdapat dalam suatu biakan yang populasi selnya tidak tumbuh dapat memanjang, morfologi sel akan membengkak secara abnormal, atau mengalami penyimpangan, suatu manifestasi pertumbuhan yang tidak seimbang. Alasan sel tidak melakukan pembelahan sel pada fase statis bermacam-macam. Beberapa alasan yaitu nutrien pada media habis, adanya akumulasi metabolit toksik (misalnya alkohol, asam, dan basa), penurunan kadar oksigen, dan penurunan ketersediaan air sebagai bahan pendukung metabolisme. 2.2.4.

Fase Penurunan Populasi Atau Fase Kematian Pada saat medium kehabisan nutrien maka populasi bakteri akan menurun

jumlahnya, Pada saat ini jumlah sel yang mati lebih banyak daripada sel yang hidup. Penyebab utama kematian adalah autolisis sel dan penurunan energi seluler. Beberapa bakteri hanya mampu bertahan beberapa jam selama fase statis dan akhirnya masuk ke dalam fase kematian, sementara itu beberapa bakteri hanya

6

mampu bertahan sampai harian dan mingguan pada fase statis dan akhirnya masuk ke fase kematian. Beberapa bakteri bahkan mampu bertahan sampai puluhan tahun sebelum mati, yaitu mengubah sel menjadi spora menunggu lingkungan sesuai. 2.3.

Pengukuran Koloni Kurva pertumbuhan adalah kurva yang sering digunakan, ada berbagai

cara untuk mendaptkan data kurva perkembangan inokulan. Cara yang paling sering untuk perhitungan adalah pengenceran, penggunaan ruang hitung, penggunaan turbidometer atau nefelometer. Pengukuran kuantitatif populasi mikroba seringkali sangat diperlukan dalam berbagai macam penelahaan mikroorganisme. Hakikatnya terdapat dua macam pengukuran dasar, antara lain penentuan jumlah sel dan penentuan massa sel. Pengukuran jumlah sel biasanya dilakukan untuk organisme bersel tunggal contohnya adalah bakteri. Penentuan massa sel dapat dilakukan bukan hanya untuk organisme bersel tunggal, tetapi juga untuk organisme berfilamen misalnya pada inokulasi jamur kapang (Noverita, 2009). Terdapat berbagai cara untuk mengukur jumlah sel antara lain dengan menggunakan hitungan cawan atau pengenceran. Menggunakan hitungan mikroskopis langsung atau penggunaan ruang hitung. Elektronis dengan bantuan alat yang disebut penghitung coulter dan penggunaan turbidometer atau nefelometer. Cara lain untuk mengukur jumlah sel antara lain dengan penyaring sampel dengan menggunakan suatu saringan yang memiliki membran, lalu bahan tersebut akan diinkubasikan pada permukaan medium yang sesuai. Jasad-jasad renik yang tertahan pada permukaan saringan atau membran akan menyerap nutrien dari medium dan menghasilkan koloni-koloni yang masingmasing berasal dari satu sel tunggal yang dapat hidup. Koloni-koloni yang dihasilkan kemudian dapat dihitung jumlahnya. Massa sel juga dapat ditentukan dengan menggunakan beberapa metode. Pengukuran sel yang salah satunya paling umum digunakan adalah pengukuran kekeruhan suspensi sel. 2.3.1.

Penentuan jumlah koloni dengan menggunakan colony counter Penentuan jumlah koloni dapat dilakukan dengan menghitung jumlah

bakteri yang membentuk koloni dalam suatu media biakan yang sesuai dengan pertumbuhan bakteri. Menghitung jumlah bakteri yang membentuk suspensi dalam

7

suatu medium tumbuh berfasa cair. Cara yang paling umum digunakan dalam menghitung jumlah bakteri adalah cara perhitungan koloni total pada lempeng. Perhitungan dengan metode ini mendasarkan perhitungan hanya pada bakteri yang hidup, sehingga cara ini dikenal juga dengan metode perhitungan bakteri hidup. Teknik ini perhitungan jumlah koloni bakteri dilakukan dengan cara pemeriksaan bahan (sampel) diencerkan dengan perbandingan 1:10 atau seperlunya sesuai dengan karakteristik sampel bakteri. Suspensi pengenceran akan ditanam dengan metode cawan tuang (pour plate) atau cawan sebar (spread plate). Penentuan jumlah koloni bakteri dapat dibantu dengan menggunakan alat, yaitu colony counter. Colony counter adalah alat untuk menghitung jumlah koloni bakteri atau mikroorganisme dalam cawan petri yang biasanya dilengkapi dengan pencatat elektronik. Perhitungan jumlah koloni bakteri dengan menggunakan alat colony counter dipermudah dengan adanya counter electronic. Counter tersebut dapat menandai koloni bakteri yang dihitung dengan menggunakan pen yang terhubung dengan counter. Penentuan jumlah bakteri dengan metode lempeng total dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu metode cawan tuang dan cawan sebar. Metode cawan tuang, mikroba ditumbuhkan dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan stok kultur bakteri sehingga selsel tersebut tersebar merata dan diam baik dipermukaan atau di dalam agar. Metode cawan sebar adalah suatu teknik menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri di atas media agar yang telah memadat. Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata di media agar. Penggunaan metode cawan sebar dan cawan tuang sangat penting untuk melakukan pengenceran agar jumlah koloni yang tumbuh pada media agar tidak terlalu banyak. Cawan yang ditumbuhi beberapa sel tidak dalam bentuk koloni tunggal dapat menyebabkan perhitungan yang salah (Nurcahyo, 2011). 2.5.2.

Penentuan Jumlah Sel Bakteri Menggunakan Metode Spektrofotometri Penentuan jumlah sel bakteri selain dilakukan dengan teknik menghitung

jumlah kelompok massa tertentu sel (koloni) yang dapat tumbuh pada lempeng pembiakan. Penentuan dapat pula ditentukan dengan menghitung jumlah populasi atau kelompok sel-sel bakteri yang terdapat dalam medium cair. Sel pada dasarnya

8

adalah partikel materi yang memiliki kemampuan untuk menyerap atau meyebarkan cahaya yang sebanding dengan tingkat kekeruhannya. Metode penentuan jumlah koloni yang didasarkan pada tingkat kekeruhan salah satunya adalah metode turbidimetri. Prinsip dasar dalam penentuan jumlah populasi bakteri dengan menggunakan spektrofotometri. Pengukuran turbidimetri, jumlah populasi bakteri dihitung sebagai serapan cahaya (absorbansi) oleh sel-sel bakteri dengna menggunakan panjang gelombang yang sesuai untuk melakukan analisa pada mikroba yang ditentukan, sehingga hanya mikroba yang diinginkan yang terlihat. Berbeda dengan teknik perhitungan jumlah koloni total pada lempeng biakan yang menghitung hanya koloni yang hidup, mikroba yang ditentukan. Berbeda dengan teknik perhitungan jumlah koloni total metode penentuan populasi sel bakteri dengan teknik spektrofotometri. Teknik spektrofotometri ini dipakai untuk menghitung jumlah sel dihitung sebagai jumlah total sel hidup dan sel mati. Metode mikroskopis langsung, sampel yang akan dihitung jumlah mikrobanya diletakkan di ruang hitung dan jumlah sel dapat ditentukan secara langsung dengan bantuan mikroskop. Metode ini hasil pengencerannya tidak ditanamkan pada media, tetapi diteteskan ke dalam ruang hitung. Keuntungan menggunakan metode ini adalah pelaksanannya yang cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan. Kelemahannya adalah tidak dapat membedakan manakah sel-sel yang masih hidup dan sel yang sudah mati. Sel mati akan menyerap warna biru, sedangkan sel hidup mereduksi zat warna secara enzimatif menjadi tidak berwarna. Cara lain adalah mengukur berat kering sel atau filamen miselum sampel dalam volume tertentu. Penentuan yang disebutkan terakhir ini sampel mula-mula disentrifugal atau disaring, dicuci, dikeringkan dan kemudian beratnya ditimbang. Perhitungan dengan cawan (pengenceran), disiapkan beberapa buah tabung berisi aquadest steril sebanyak 9 ml. Masing-masing tabung kemudian ditambahkan 1 ml sampel yang akan diperiksa secara bertahap hingga mencapai hasil yang diinginkan. 2.4.

Bioremediasi Bioremediasi

dapat

didefinisikan

sebagai

setiap

proses

yang

menggunakan mikroorganisme, fungi, tanaman hijau atau enzim untuk kembali pada lingkungan alam sehingga diubah oleh kontaminan dengan kondisi aslinya.

9

Bioremediasi dapat digunakan untuk pencemar tanah seperti degradasi klorinasi hidrokarbon oleh bakteri. Sebuah contoh pendekatan yang lebih umum adalah pembersihan dari tumpahan minyak dengan penambahan nitrat atau sulfat pupuk untuk memfasilitasi dekomposisi minyak mentah oleh jenis bakteri pribumi. Bioremediasi dan fitoremediasi telah digunakan selama berabad-abad. Sebagai contoh, desalinasi lahan pertanian dengan phytoextraction memiliki tradisi yang panjang. Teknologi bioremediasi yang menggunakan mikroorganisme ditemukan oleh George Robinson. Selama tahun 1960 menghabiskan waktu luangnya untuk bereksperimen dengan stoples kotor dan berbagai campuran mikroba dengan mangamati perkembangbiakkan dari mikroba tersebut. Pada toples mana mikroba tersebut paling banyak tumbuh. Bioremediasi teknologi secara umum dapat diklasifikasikan sebagai metode lanjutan. Pada teknologi tersebut melibatkan bioremediasi yang memperlakukan bahan yang telah terkontaminasi pada situs sementara tempat penampungan yang melibatkan penghapusan bahan terkontaminasi untuk diperlakukan di tempat lain. Beberapa contoh dalam teknologi dari bioremediasi adalah bioventing, land farming, bioreaktor,proses pembuatan kompos, augmentation, rhizo filtration, dan juga biostimulation. Bioremediasi dapat terjadi dengan sendirinya (bioremediasi intrinsik) yang didorong melalui penambahan pupuk untuk meningkatkan ketersediaan hayati dalam suatu media (stimulation). Kemajuan pada segala bidang kehidupan mengakibatkan banyak penemuan terbaru juga yang dapat terbukti mampu dilakukan untuk menyukseskan kembali melalui penambahan strain mikroba yang cocok untuk medium agar meningkatkan populasi mikroba dengan kemampuan untuk mendorong adanya mikroorganisme contaminants. Mikroorganisme yang dapat melakukan fungsi bioremediasi dikenal sebagai bioremediators. Penghapusan polutan dan limbah dari lingkungan membutuhkan peningkatan pemahaman tentang kepentingan relatif dari jalur yang berbeda dan jaringan peraturan untuk aliran karbon dalam lingkungan tertentu dan untuk senyawa tertentu dimana mereka pasti akan mempercepat pengembangan teknologi bioremediasi dan bio transformasi proses. Penggunaan rekayasa genetika untuk menciptakan organisme yang khusus dirancang untuk bioremediasi memiliki

10

potensi besar. Bakteri Deinococcus radiodurans yang paling berkembang adalah organisme yang dikenal telah dimodifikasi dengan menggunakan rekayasa genetik untuk mengonsumsi dan mencerna toluena dan merkuri limbah radioaktif nuklir. Mycoremediation adalah bentuk bioremediasi dimana jamur digunakan untuk dekontaminasi daerah tersebut. Istilah ini mycoremediation diciptakan oleh Paulus Stamets dan mengacu khusus untuk penggunaan jamur miselia dalam bioremediasi. Salah satu tugas utama dari jamur dalam ekosistem adalah dekomposisi yang dilakukan oleh miselium. Miselium mengeluarkan ekstra seluler enzim dan asam yang memecah lignin dan selulosa, untuk membentuk bangunan utama serat tanaman. Senyawa organik terdiri dari rantai panjang karbon dan hidrogen yang secara struktural mirip dengan bahan pencemar organik yang banyak ditemukan. Fungsi mycoremediation adalah menentukan jenis jamur untuk mengikat polutan tertentu. Strain tertentu telah berhasil menurunkan gas.. Pada sebuah penelitian yang dilakukan terbukti bahwa penyumbang utama faktor dalam industri bioremediasi adalah sebidang tanah yang telah terkontaminasi dengan minyak diesel yang diinokulasi dengan miselium dari jamur tiram. Teknik bioremediasi bakteri tradisional yang digunakan adalah dengan melakukan kontrol setelah empat minggu didapatkan hasil lebih 95% dari banyak hidrokarbon polisiklik aromatik telah menurun kadar beracunnya pada komponen yang tidak diinokulasi dalam miselium. Disimpulkan bahwa komunitas mikroba alami berpartisipasi dengan jamur untuk mendorong kontaminan keluar yang akhirnya menjadi karbondioksida dan air. Menurunkan kontaminasi jamur pada kayu sangat efektif dalam mengurai polutan aromatik (komponen beracun dari minyak bumi) juga senyawa klor yang dapat merusak lingkungan yang ada disekitar. Mycofiltration adalah salah satu proses yang sama yaitu dengan menggunakan miselia jamur untuk menyaring limbah beracun dan mikroorganisme dari air di dalam tanah. Terdapat kerugian karena biaya yang tinggi tapi keuntungannya efisiensi untuk bioremediasi juga cukup tinggi karena dapat digunakan di daerah yang tidak dapat diakses tanpa penggalian. Sebagai contoh, hidrokarbon tumpahan (khususnya bensin tumpahan) atau larutan chlorinated tertentu dapat mencemari air tanah dan akseptor elektron yang sesuai atau

11

pentransferan pada elektron yang cocok digunakan secara signifikan dapat mengurangi kontaminan pada konsentrasi setelah waktu yang cukup lama. Hal ini biasanya jauh lebih murah daripada penggalian diikuti oleh pembuangan di tempat lain dengan inisiasi atau perlakuan penampungan strategi lain. Terdapat 4 teknik dasar yang biasa digunakan dalam bioremedasi yaitu stimulasi aktivitas mikroorganisme asli pada lokasi tercemar dengan penambahan nutrien, pengaturan kondisi bilangan redoks, optimasi pH, inokulasi (penanaman) mikroorganisme di lokasi tercemar serta dapat digunakan pada mikroorganisme yang memiliki kemampuan untuk melakukan biotransformasi khusus. 2.6.

Pemisahan Spesies Pada keadaan yang sebenarnya (di alam bebas) boleh dikatakan tidak ada

bakteri yang hidup benar benar tersendiri terlepas dari spesies bakteri lainnya. Untuk menyendirikan suatu spesies dapat dilakukan dengan pengenceran sampel. Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam spesies diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Enceran ini kemudian akan diambil sejumlah 1 ml untuk kemudian dincerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini akan diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin dapat juga hanya memperoleh satu koloni saja kemudian dilakukan pengenceran berulang (Pelczar dan Chan, 20017). Metode yang lain dengan penuangan, yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan tadi, dan sampel ini kemudian disebarluaskan didalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Maka demikian diperolehlah suatu piaraan adukan. Setelah medium itu mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni-koloni yang masing-masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang proses akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin dengan penggesekan, metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan waktu yang begitu lama, hanya saja dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat tumbuh. Jika ujung kawat inokulasi dibengkokan, kemudian ujung kawat inokulasi itu setelah disentuhkan suatu koloni lalu digesekkan pada permukaan medium padat, maka beberapa waktu kemudian akan tampaklah koloni-koloni yang letaknya tersebar di permukaan medium tersebut.

12

Jika diadakan pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil, maka akan diperoleh suatu piaraan murni, dengan mengucilkan satu sel (Single Cell Isolation). Mikropipet ditempatkan pada tangan-tangan dari suatu mikromanipulator. Mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kaca penutup. Jika tampak suatu tetesan hanya mengandung satu bakteri, maka dengan lain mikropipet tetesan tersebut dipindahkan ke medium encer dengan maksud supaya bakteri tersebut berkembang biak dulu. Kemudian diperoleh piaraan murni. Metode ini sangat memerlukan kesabaran, dan mikromanipulator sangat mahal. Dengan inokulasi hewan, metode ini didasarkan atas suatu kenyataan, bahwa tidak semua bakteri dapat tumbuh didalam tubuh seekor hewan. Sampel air liur dari seseorang yang disangka menderita TBC. Jika air liur ini disuntikkan ke dalam tubuh tikus putih, maka bakteri-bakteri saproba yang ikut serta itu tidak akan bertahan, sehingga kemudian hanya diperoleh hasil TBC saja. Bakteri yang ketinggalan dalam tubuh tikus dapat dipindahkan kedalam medium yang sesuai. Oleh karena hal ini juga yang dapat menjangkit ke tubuh manusia. 2.7.

Jamur Secara umum, jamur dapat didefinisikan sebagai organisme eukariotik

yang mempunyai inti dan organel (Nurcahyo, 2011). Jamur tersusun dari hifa yang merupakan benang-benang sel tunggal panjang, sedangkan kumpulan hifa disebut dengan miselium. Miselium merupakan massa benang yang cukup besar dibentuk dari hifa yang saling membelit pada saat jamur tumbuh. Jamur mudah dikenal dengan melihat warna miseliumnya. Bagian penting tubuh jamur adalah suatu struktur berbentuk tabung menyerupai seuntai benang panjang, ada yang tidak bersekat dan ada yang berbentuk bersekat. Untain disebut dengan nama hifa, hifa dapat tumbuh bercabang-cabang sehingga membentuk jaring-jaring, bentuk ini dinamakan miselium. Pada koloni jamur ada hifa yang menjalar dan ada hifa yang tegak. Umumnya hifa yang tegak ini menghasilkan alat-alat pembiak yang disebut spora, sedangkan hifa yang menjalar berfungsi menyerap nutrien dari substrat dan untuk menyangga alat reproduksi. Hifa yang menjalar disebut hifa vegetatif dan hifa yang tegak disebut hifa fertil. Pertumbuhan hifa berlangsung terus-menerus pada bagian apikal, sehingga panjangnya tidak dapat ditentukan.

13