Aula 9 E 10

Curso Básico de purificação de Proteínas. Marcus Aurélio Miranda de Araújo Enzimologia – farmácia - UnB

Estabilização das proteínas •

Uma vez removida do seu ambiente natural, ela fica exposta a muitos agentes que podem danificála de forma irreversível.

•

Fatores que devem ser considerados: 1. 2. 3. 4. 5.

pH Temperatura Presença de enzimas degradativas (proteases) Armazenamento por longo tempo (contaminação, oxidação) Adsorção a superfície

Tabela com os métodos comuns de purificação de proteína. • os procedimentos de purificação são voltados para manter a proteína nos estado nativo, embora algumas proteínas possam se renaturar. • para purificar uma proteína de uma mistura, bioquímicos exploram as diferenças entre elas. Elas diferem em: • termoestabilidade, • pH.

Property

Methods

solubility

Precipitation with ammonium sulfate (salting out)*

Size / shape

Size-exclusion chromotography

Isoelectricpoint (charge)

Ion exhange chromatography

binding to small molecules

Affinity chromatography

Purification is a multi-step procedure. Sample

Separation technique

Repeat with another separation technique until pure

Fractionation

No Assay total protein Assay enzyme activity

Set aside

No

Is there activity?

yes

Combine Fractions

Monitor purity

Pure?

yes

Prepare for analytical technique

First steps: Preparing the sample – Crude extract.

Protein from cells or tissue Supernatant with Soluble protein Break cells, tissue, or organ

Microbial cells or tissue

Blender, homogenizer, sonication, pressure, psmotic

Pellet with intact cells, organelles, membranes and membrane proteins

Solubilidade das proteínas

• Precipitação (NH4)2SO4:

com

sulfato

de

amônia

Muitas proteínas são insoluveis em altas concentrações de sal, o que a torna uma técnica viável.

Solubilidade das proteínas • Salting-in →

íons adicionados blindam as várias cargas da proteína , enfraquecendo as forças de atração.

• Salting-out →

solubilidade da proteína volta a decrescer e com isso precipita.

Solubilidade das proteínas • Mecanismo: • As proteínas são solúveis em soluções aquosas, • Quando se adiciona sal, a água para de interagir com a proteína para interagir com o sal. • Inicialmente a água sai das regiões hidrofóbicas da proteína, devido a baixa afinidade por estas regiões. • Estas regiões hidrofóbicas são instáveis e tendem a se interagir, formando um agregado de proteínas que precipita. • Este é o termo denominado ´´Salting out``.

• Qual a melhor concentração de Sulfato de Amônia? – 100% de sulfato de amônia precipita a maioria das proteínas. – Diferentes concentrações do sulfato de amônia pode precipitar diferentes proteínas: • Baixas concentrações precipita pouca proteína, • Altas concentrações precipita muitas proteínas.

Cromatografia • São necessário: 1) mistura de proteínas, 2) fase estacionária: resina que será usada para purificar, 3) fase móvel: tampão.

• Conceitos básicos: – se a proteína tiver alta afinidade pela resina do que pela fase móvel, a proteína irá mover-se lentamente. – Se a proteína tiver uma alta afinidade pela fase móvel do que pela resina, a proteína irá mover-se. – A afinidade é baseada no tamanha, carga, solubilidade ou interação especifica.

Classes de cromatografias:

Pode ser utilizado para realizar uma corrida cromatográfica:

• 1) Gravity Flow • 2) Peristaltic Pump • 3) FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography) • 4) HPLC (High Pressure Liquid Chromatography)

Cromatografia de troca-iônica. • Conceitos básicos: – Proteínas são separadas de acordo com a – – – –

carga. Uma resina carregada é usada como fase estacionária. A fase móvel é composta de um tampão com carga neutra ou carga, deve-se levar em consideração o ponto isoelétrico da proteína, em pH 7,0 a maioria das proteínas (~85%) são carregadas negativamente.

Cromatografia de troca-iônica. • Tipos de resinas de troca-iônica: – 1) Aniônica (resina positiva) – 2) Catiônica (resina negativa)

• A cadeia central da resina é formada por uma molécula de carbohidrato (bead). • Anion exchangers or cation exchangers são ligados covalentemente aos beads.

Cromatografia de troca-iônica. pos pos

pos

• Matriz com carga positiva • Apenas proteínas com cargas positivas passam pela coluna.

pos

pos pos

Only the POS charged proteins run through the column.

20

How can we elute the other proteins?

1 Tubes march in from left

A280

Fraction #

Add salt

Increase the salt.

Tubes march in from left

A280

Fraction #

Increase the salt. What protein will come of the column next?

Add salt

-

-

---

Don’t show the charges on the color spots students should figure this out on their own!

Tubes march in from left

A280

Fraction #

Increase the salt. What protein(s) will come of the column next? Feedback statement.

+

Run column

Tubes march in from left

A280

Fraction #

---

---

Red and yellow will have the same neg charge and will coelute.

1.5

Tubes march in from left

A280

Salt concentration

0.0 Fraction #

Add salt

Increase the salt concentration

1.5

Tubes march in from left

A280

Salt concentration

0.0 Fraction #

Run the column.

Run column

1.5

Tubes march in from left

A280

Salt concentration

0.0 Fraction #

1.5

Tubes march in from left

A280

Salt concentration

0.0 Fraction #

Cromatografia de gel filtração • Conceitos básicos: – Proteína é purificada de acordo com o seu tamanho. – Os beads da resina apresentam pequenos buracos. – o tempo de retenção depende do tamanho da proteína. – Se a proteína for muito grande ela será eluída no volume de exclusão.

• The matrix of a sizeexclusion chromatography Run column column is porous beads. Need two pore sizes (other size bigger than black proteins, smaller than existing pores.)

• The matrix of a gel filtration column are beads with pores. • The large green proteins can’t fit in pores so flows faster. • The red/yellow medium sized proteins get trapped in the pores. • The black small proteins stay trapped in pores longer.

Cromatografia de afinidade • Conceitos básicos: – Um ligante especifico para determinada proteína é imobilizado nos beads. – apenas a proteína de interesse se liga na coluna, ou seja é retida na fase estacionária. – a proteína é eluída pela adição de uma alta concentração de um ligante competitivo.

HPLC (High pressure liquid chromatography) – Predominantemente usado para purificação de pequenas moléculas orgânicas, pequenos peptídeos. – As resinas são fisicamente fortes e podem surportar altas pressões. – As colunas são, usualmente, do tipo partição (interação hidrofóbica, fase reversa C18 ou sílica).

• Vantagens: – Alta resolução – os picos são bem definidos, e é necessário pouca fase móvel. – Rápida separação – usualmente o tempo de corrida é menor que uma hora. – Automação.

• Desvantagens: – desnaturação de muitos complexos proteícos. – Rendimento baixo. – muito caro (80.000 $ para as bombas, detectores + 1.000 – 5.000 $ pelas colunas).

FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography). – combina um sistema programável de bombas não peirstalticas que podem utilizar pressões intermediárias, com um detector UV/VIS, e uma extensa livraria de colunas. – as colunas incluem; troca-ionica, gel filtração, adsorção, afinidade, etc.

• Vantagens: – Alta resolução, – corridas utilizando um pequeno tempo, – Boa reprodutibilidade.

• Desvantagens: – Custo!! (40,000$, + columns run 1,000$ to 5,000$), – Rendimento baixo.