Aula 6

  • November 2019
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AULA 6 – PARTE I: Bioquímica dos Ácidos Nucleicos Transcrição e processamento de RNA

OS GTF’s: análogos do factor sigma Os GTF’s são gerais de transcrição, que são necessários para a transcrição de todos os genes, participando na formação do complexo iniciador da transcrição perto do local de iniciação. Na figura 1a) podemos ver a representação da ligação do factor sigma à RNA Polimerase aquando da iniciação da transcrição nas bactérias. Em 1b) vemos a ligação da RNA Polimerase à sequencia iniciadora da transcrição e dos factores gerais de transcrição à TATA-box (-35, -25) e ao DPE (elemento do núcleo promotor a montante, +30), nos eucariotas.

Figura 1 a) Promotor bacteriano b) Promotor Eucariótico

Os GTF’s da RNA Polimerase II TFII - factor de transcrição para a RNA Polimerase II Existem várias classes de factores de factores de transcrição para a RNA Polimerase II: • • • • • •

TFIID TFIIA TFIIB TFIIE TFIIF TFIIH

Figura 2 – Classes de TFII

Sem a ligação de todos estes factores, não há transcrição. André F.S.N. Úrsula

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Formação do Complexo de Pré-Iniciação da RNA Polimerase II

Figura 3 – Formação do Complexo de Pré-Iniciação

TFIID • •

É um complexo proteíco múltiplo É composto por dois tipos de proteínas: • TBP (que se vai ligar à TATA-box) • 14 tipos de TAFs (factores associados à TBP)

Figura 4 – Complexo proteíco do TFIID



É o primeiro factor a ligar-se e que vai catalizar a ligação dos outros factores.

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TBP • • • •

Liga-se à TATA-box Provoca a desdobragem do DNA O complexo DNA-TBP vai servir de plataforma para a ligação sequencial do TFIIA, TFIIB e os TAF’s. É considerado o factor de transcrição universal, tendo papel fundamental na transcrição pela acção da RNA Polimerase I, II e III. Figura 5 – Representação tridimensional do TBP e da sua ligação ao DNA

TAFs • • • • •

Factores associados ao TBP As suas subunidades contêm histonas dobradas, formando 5 pares de histonas. Inicialmente foram descritos como coactivadores essenciais em vez dos GTFs Não são essenciais universalmente; os promotores têm uma variedade de requisitos para os TAFs A necessidade dos TAFs é definida pelos elementos que constituem o núcleo promotor.

Figura 6 – Complexo proteíco do TFIID

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Funções dos TAFs • • • •

Vão-se ligar aos elementos constituintes do promotor e interagir com os factores de transcrição específicos de cada gene. O TAF1 e TAF2 ligam-se ao INR (sequência iniciadora) O TAF6 e TAF9 ligam-se ao DPE TAF12 interage com as proteínas activadoras

Figura 7 – Locais de ligação das TAFs

Estrutura Tridimensional do TFIID • • • • •

A microscopia electrónica revela que o TFIID que a forma de uma ferradura O dsDNA vai ligar-se ao sulco Possui duas conformações: aberta e fechada A abertura ou fecho induz ou não a ligação da cadeia de DNA ao sulco A TFIID actua como uma “pinça” molecular que se liga ao DNA

Figura 8 – Estrutura tridimensional do TFIID; a seta indica o sulco onde o dsDNA se vai ligar

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O TFIID será sempre necessário? Sim. 1. Os promotores podem ser independentes dos TAFs: mas possuem a TATA-box onde há ligação 2. Os promotores podem não ter a TATA-box, logo não têm ligação ao TBP, mas requerem TAFs (TFIID), possuindo outra sequência onde irá dar-se a ligação.

Figura 9 – I: núcleos promotores que não necessitam de TAF; II: núcleos promotores sem TATA-box

Os complexos de TBP não são tão necessários quanto os TAF: • • • •

Nenhum contém TBP; todos contêm um subconjunto de TAFs Reconhece uma sequência específica de elementos dos núcleos promotores É recrutado para os promotores por activadores Tem como função ser coactivador transcripcional

TFIIA • • • •

É composto por 3 subunidades Liga-se ao núcleo promotor, estabilizando o complexo TBPDNA Bloqueia os inibidores da transcrição Por vezes é cofactor em vez de GTF porque não é absolutamente essencial para iniciar a transcrição.

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TFIIB • • • • •

Figura 10 – Complexo TFIIA/TBP/DNA

Só uma subunidade Liga-se à BRE (região que reconhece o TFIIB e que se encontra antes da TATAbox no promotor) Ajuda a definir o local de início da transcrição Ajuda na limpeza do promotor Estruturas 3D: • Zn-ribbon • B-finger • Dominio nuclear Figura 11 – TFIIB no complexo TBP/TFIIA/DNA

TFIIF • • • • •

Constituído por 2 subunidades: dímero Liga-se à RNA Polimerase II Acompanha a RNA Polimerase II até ao PIC (função similar à do factor sigma nas bactérias) Facilita a abertura dp promotor (separação das cadeias de DNA) Influencia o local de iniciação tal como o TFIIB.

Figura 12 – TFIIF

TFIIE • • • • • •

Constituído por 2 subunidades Heterodímero: subunidade de 34kDa e de 56kDa Liga-se ao promotor num local próximo ao local de iniciação da transcrição Cria o local de ligação para o TFIIH Estrutura 3D: Tal como o TFIIF, inclui domínios “winged helix” (domínios em forma de asa) Figura 13 – TFIIE

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TFIIH • •





É um complexo de múltiplas subunidades: possui 10 subunidades de 500 kDa Tem 3 funções: • Transcrição: promove a abertura das cadeias de DNA do promotor e a saída da RNA Polimerase II • Reparação do DNA • Progressão do ciclo celular Actividades catalíticas: • Domínio C-terminal da RNA Polimerase II (CTD) cinase (fosforila o CTD da Pol II) • ATPase dependente de DNA • DNA helicase 5’-3’ • DNA helicase 3’-5’ • E3 ubiquitina ligase (reparação do DNA) Estrutura em microscópio electrónico: possui uma cavidade no centro do complexo, o que sugere o mecanismo para a abertura do DNA promotor Figura 14 – TFIIH e sua estrutura tridimensional

TFIIH: Estrutura da subunidade

Figura 15 – TFIIH: estrutura da subunidade

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Como é que a Pol II reconhece o gene?

Figura 16 – Núcleo promotor

Requisitos para o reconhecimento: • •

Núcleo promotor RNA Polimerase II e GTFs

Pol II É uma estrutura de 12 subunidades: • Núcleo promotor: Rpb1, Rpb2, Rpb3, Rpb 11 (Rpb: RNA polimerase B) • Subunidades partilhadas pelas Pol I, II e III: Rpb5, Rpb6, Rpb8, Rpb10, Rpb12 • As subunidades Rpb4, Rpb7 e Rpb9 são necessárias à iniciação do processo de transcrição mas não são essenciais para a elongação. Factores de Transcrição Específicos • • • •

• •

Reconhecem sequências específicas do DNA Controlam especificamente o padrão de expressão de um dado gene Factores a montante (Upstream): reconhecem sequências específicas de DNA próximas do promotor (ex: Sp1) Factores indutores: reconhecem sequências de DNA designadas por elementos de resposta: • Controlam os parâmetros de transcrição (tempo e espaço) • Família de receptores nucleares: paradigma para os factores de transcrição específicos Ligam-se ao Enhancer Têm vários domínios: • Zonas de ligação ao DNA (BD) • Zonas de ligação ao ligando (L) • Zonas de activação (AD)

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Figura 17 – Ligação ao Enhancer

Especificidade dos Activadores •

A especificidade dos activadores depende da sequência de DNA que é reconhecida pelo activador

Figura 18 – Reconhecimento pelo activador

Ciclo de transcrição pela RNA Polimerase II Como podemos observar na figura 19, a ligação da RNA Polimerase II aos GTFs promove a ligação dos TFII para formar o Complexo de PréIniciação (PIC), ocorrendo isomerização formando um complexo aberto que pode levar a duas situações diferentes: • Ligam-se ribonucleótidos de trifosfatos (NTPs), dando-se o primeiro passo da transcrição, a iniciação, remoção do promoto, elongação e terminação, dando origem ao RNA. • A Polimerase II, bem como o TFIIB e o TFIIF desligam-se do complexo e forma-se um complexo scaffold, ao qual se podem voltar a ligar os elementos que se dissociaram anteriormente, dando-se uma reinciação do processo.

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Figura 19 – Ciclo de transcrição pela RNA Polimerase II

Elongação • • • • • • •

Adição de nucleótidos para alongar a cadeia de RNA Remoção do promotor Remoção dos factores de transcrição TFIIE e TFIIF Síntese de RNA pela Polimerase II TFIIF continua associado à Polimerase II Os factores de elongação associam-se à Polimerase II, havendo aumento da actividade desta enzima O domínio C-terminal da Polimerase II continua fosforilado

Terminação • •

• •

A sequência sinal Poli(A) é transcrita, dando o sinal para que a transcrição acabe. Esta sequência encontra-se na região 3C nãotraduzida (UTR) Existem dois modelos para a terminação da transcrição pela Polimerase II: • anti-terminação – a Polimerase II sofre alteração da conformação e abandona o complexo • torpedo – o transcripto primário (RNA) é clivado e o terminal 5’ é degradado por uma exonuclease, libertando a Polimerase II A cadeia dupla do DNA é restaurada A molécula de RNA e a Polimerase II são libertadas

___________________________________________________________________________ Bibliografia da 6ª aula: COOPER, Geoffrey M., e HAUSMAN, Robert E., The Cell: A Molecular Approach, 4.ª Edição, Sinauer Associates, 2007. DEVLIN, Thomas M., Textbook of biochemistry with clinical correlations, 5.ª Edição, John Wiley & Sons, 2002. LODISH, e outros, Molecular Cell Biology, 5.ª Edição, W. H. Freeman. Slides das aulas teóricas.

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