Aula 2 Sebenta De Bactereologia

AULA Nº 2 – Morfologia e Estrutura das Células Bacterianas Técnica básica de observação de bactérias Os microorganismos vivos podem ser observados directamente com o microscópio óptico, sendo frequentemente corados e fixados para melhorar a visualização. A coloração pode ser simples (com um corante) ou diferencial.

Figura 2.1 – Técnica básica de observação de bactérias Fixação Processo onde os microorganismos são mortos e presos firmemente á lamela e há inactivação das suas enzimas. Existem 2 tipos de fixação: - Fixação química: protege a estrutura e morfologia dos microorganismos mais delicados. Químicos reagem com os componentes celulares (proteínas e lípidos). - Fixação ao calor: preserva a morfologia global mas não as estruturas no interior das células. Coloração Os vários corantes têm 2 características em comum: tem grupos cromóforos e podem ligar-se ás células por ligações iónicas, covalentes ou hidrofóbicas (ex.: estruturas positivas ligam-se ás negativas). Existem 2 classes de corantes iónicos, consoante a natureza do grupo com carga: - Corante básico (ex.: azul de metileno, cristal violeta): tem grupos carregados positivamente. Ligam-se às moléculas com carga negativa como os ácidos nucleícos e muitas proteínas. - Corante ácido (ex.: eosina, fucsina ácida): tem grupos carregados negativamente.

O pH influência a coloração, uma vez que altera a natureza e carga das estruturas celulares (ex. a coloração básica é mais efectiva a pH’s elevados). ► Tamanho, forma e arranjo A

maioria

das

bactérias encontradas tem 1 de 2 formas: - Cocos(esféricas) Podem células

existir

como

individuais

ou

associadas em arranjos característicos (ex.:Diplococcus, tetrada…) quando ocorre divisão celular num plano ou

mais,

regular

irregularmente, células

e

ou as

permanecem

juntas. - Bacilos (têm formas e tamanhos variados). Também podem aparecer isolados ou em cadeias, ter formas espiraladas e encurvadas e aí são chamados espirilos (estrutura rígida) ou espiroquetas (estrutura flexível).

► Estrutura das células procariotas

As delimitadas

células pela

procariotas parede

são

celular.

Interiormente a esta encontra-se o espaço periplasmático e depois a membrana plasmática que pode ser invaginada para formar no interior citoplasmático estruturas membranosas. Podem usar flagelos para locomoção. O material genético encontra-se no nucleóide que não possui membrana. Podem ser encontrados ribossomas e corpos de inclusão na matriz citoplasmática. Algumas células são envoltas por uma cápsula ou membrana externa à parede celular. Membrana plasmática

Sistema altamente organizado, assimétrico, flexível e dinâmico que envolve o citoplasma. Constituída por proteínas e lípidos. Os lípidos são anfipáticos, tendo uma extremidade polar e outra apolar. A terminação polar interage com a água sendo por isso hidrofílica, enquanto que a terminação apolar, hidrofóbica, é insolúvel em água. Este

arranjo permite a formação de uma bicamada (2 folhetos) ficando a parte hidrofóbica no interior da

bicamada.

Muitos

destes

lípidos

são

fosfolípidos. As membranas bacterianas diferem das eucariotas por terem maior quantidade de proteínas

e

por

possuírem

hopanóides

(sintetizados a partir dos mesmos percursores que os esteróides) em vez de colesterol. O

modelo

aceite

para

explicar

a

estruturas das membranas é o modelo do mosaico fluido e este distingue 2 tipos de proteínas de membrana: - Proteínas periféricas: fracamente ligadas á membrana e podem ser facilmente removidas. São solúveis em solução aquosa e constituem 20-30% do total de proteínas da membrana. - Proteínas integrais: (70-80% das proteínas de membrana) Não são facilmente removidas da membrana e são insolúveis em solução aquosa. São anfipáticas e as suas regiões hidrofóbicas encontram-se ligadas ao interior da membrana lipidica, enquanto as porções hidrofílicas se projectam a superfície. Podem difundir-se lateralmente no folheto da membrana para novas localizações, mas não podem fazer movimento de flipflop ou rotação. Frequentemente tem carbohidratos ligados com importantes funções. Funções da membrana plasmática: - Retém citoplasma, particularmente nas células sem parede celular, separando-o do meio exterior; - Barreira de permeabilidade selectiva (permite passagem de iões e moléculas particulares, tanto para dentro como para fora da célula e previne o movimento de outras); - Ajuda no transporte de moléculas que não conseguem atravessar a membrana; - Tem sistemas de transporte para obter nutrientes, excretar resíduos e para secreção de proteínas;

- É a localização de uma variedade de processos metabólicos como a respiração (célula não tem mitocôndrias), fotossíntese, síntese de lípidos, polímeros parietais e constituintes da parede celular; - Barreira osmótica; - Protecção do meio interno celular, mantendo-o constante face ás alterações externas; - Contém receptores de moléculas que ajudam a detectar e a responder a químicos, etc…; - É essencial á sobrevivência dos microorganismos. No citoplasma celular podem ser encontrados mesossomas (invaginações da membrana plasmática) que podem estar implicados na formação da parede celular ou na replicação e segregação dos cromossomas na divisão celular. Espaço periplasmático Situa-se entre a membrana plasmática e a membrana externa ou parede celular (no caso das bactérias Gram+) e esta cheio de periplasma. É constituído nas bactérias Gram– por proteínas que participam na aquisição de nutrientes (ex. enzimas hidrolíticas), proteínas de ligação envolvidas no transporte de materiais para dentro da célula, enzimas envolvidas na síntese de peptidoglicano e na modificação de compostos tóxicos que podem lesar a célula. Nas bactérias Gram+ o espaço periplasmático tem exoenzimas (secretadas pelas bactérias). Parede celular procariota É uma das partes mais importantes da célula procariota, pois é uma barreira rígida, externa á membrana plasmática que dá lhe forma e protecção contra a lise osmótica. Pode proteger a célula de substâncias tóxicas e é o local de acção de vários

antibióticos. A parede celular de certos agentes patogénicos tem componentes que contribuem para a sua patogenicidade. No caso dos micoplasmas a parede celular é inexistente. Depois de se ter desenvolvido a coloração de Gram tornou-se evidente a divisão das bactérias em 2 grandes grupos, que devido á sua estrutura característica respondem de maneira diferente á coloração de Gram: - Gram +: roxas, camada homogénea de 20-80 nm de peptidoglicano ou mureína. Parede mais forte e resistente que as Gram -. - Gram -:rosa ou vermelhas, mais complexa, 2-7nm de peptidoglicano e 7-8nm de uma membrana externa.

Estrutura do peptidoglicano: O peptidoglicano ou mureína é um enorme polímero composto por varias subunidades. Contém 2 açúcares: NAM (ácido N-acetil murâmico) e NAG (N-acetil glucosamina) que em alternância são o suporte do polímero e estão ligados por ligações

β1-4glicosídicas,

vários

aminoácidos, 3 dos quais D-ácido glutâmico, D-alanina e ácido meso diaminopimélico.

A presença de D-aminoácidos protege o ataque de várias peptidases, tornando a bactéria mais resistente para sobreviver em ambientes hostis (aminoácidos da série L são mais facilmente degradados). O NAM possui uma cadeia de 4 aminoácidos D e L alternados ligada á extremidade do grupo carboxilo. As subunidades do peptidoglicano são ligadas por ligações entre o grupo carboxilo terminal da D-alanina e o grupo amina do ácido diaminopimélico, ou por uma ponte peptídica. O arranjo final resulta numa rede enorme de peptidoglicano que dá rigidez e protege a célula das variações da pressão osmótica, bem como é responsável pela sua morfologia, em conjunto com proteínas do citosqueleto bacteriano↓.

☺ Parede celular das bactérias Gram+ Composta maioritariamente por peptidoglicano

que

contém

pontes

peptídicas, tem também ácido teicóico ligado ao peptidoglicano ou aos lípidos da membrana. No último caso são chamados ácidos lipoteicóicos. O ácido teicóico é carregado negativamente e contribui para a carga negativa da parede celular Gram+.Tem como funções ajudar na adesão das bactérias a tecidos e células e não se encontra presente na parede celular das bactérias Gram-.

☺ Parede celular das bactérias Gram-

Fina camada de peptidoglicano e exteriormente possui membrana externa. Estas estruturas estão ligadas pelas lipoproteínas de Braun e parecem estar em contacto directo através dos sítios de adesão, por onde substâncias se podem mover. A membrana externa é constituída por

lipopolissacáridos,

moléculas

que

contêm tanto lípidos como carbohidratos e consistem em 3 partes: - Lipido A, que contém 2 açucares derivados da glucosamina, cada um com 3 ácidos gordos e fosfato ou pirofosfato ligado. Está colocado na membrana externa (equivalente

ao

fosfolípido

de

uma

membrana) e a restante parte da molécula do lipopolissacárido projecta-se á superfície. É por vezes tóxico, fazendo com que o lipopolissacárido possa agir como endotoxina e causar alguns sintomas que surgem em infecções com bactérias Gram- (febre, inflamação, choque séptico). - Core polissacarídeo (cadeia de açucares) que é ligado ao lípido A. - Antigénio O, cadeia polissacarídea com vários açucares peculiares e que varia em composição entre as espécies bacterianas.

Importância dos lipopolissacarídeos: - O core polissacarídeo por conter açucares carregados e fosfatos, contribui para a carga negativa na superfície bacteriana; - Ajuda a estabilizar a membrana externa. Funções da membrana externa: - Barreira protectora; - Previne ou atrasa a entrada de sais biliares, antibióticos e outras substâncias tóxicas que possam matar ou lesar a bactéria; - Devido á presença de porinas (proteínas que juntas formam um canal) permite a passagem de pequenas moléculas hidrofílicas como a glucose e outros monossacáridos; - Previne a perda de constituintes como as enzimas periplasmáticas; - Tem sistemas de transporte específicos para moléculas grandes como a vitamina B12; - Não deixa passar compostos hidrofóbicos porque a membrana externa é polar. A parede celular e a protecção osmótica A parede celular protege a célula contra a pressão osmótica, pois o meio intracelular é mais concentrado em solutos que o meio extracelular (habitats microbianos são hipotónicos). Durante a osmose a água move-se nas membranas permeáveis de soluções diluídas (↑[H2O]) para soluções concentradas (↓[H2O]), sendo que a água normalmente entra na célula bacteriana. Se a célula não tiver parede celular a membrana plasmática não resiste a certas pressões e a célula irá inchar, acabando por rebentar – lise. Quando temos ambientes hipertónicos (↑[solutos]), a água sai da célula, levando-a a encolher – plasmólise. A importância da parede celular na protecção contra a lise osmótica é demonstrada pelo tratamento com lisozima ou penicilina. A lisozima (enzima

de

crescimento

defesa bacteriano)

contra

o

ataca

o

peptidoglicano hidrolisando as ligações β1-4 glicosídica entre o NAM e NAG, afrouxando o saco rígido da parede celular. A penicilina inibe a síntese de peptidoglicano. Se as bactérias forem incubadas com penicilina num meio com solução isotónica as bactérias Gram+ são convertidas em protoplastos que crescem normalmente mas sem parede celular. As células Gram- retêm a membrana externa depois do tratamento com penicilina e são chamadas esferoplastos. Protoplastos e esferoplastos são osmoticamente sensíveis e se forem transferidos para uma solução diluída, sofrem lise devido ao influxo incontrolável de água.

Mecanismo da coloração de Gram A coloração de Gram divide a bactéria em duas classes: Gram+ e Gram-, devido ás diferenças nas paredes celulares (se a parede celular das bactérias Gram+ for removida, elas passam a Gram-). 1- Usa primeiro um corante básico (Cristal violeta) e as bactérias ficam arroxeadas. 2- Tratamento com solução de iodo (mordente), que aumenta a interacção entre células e o corante, fazendo com que a célula core fortemente. 3- Descoloração usando etanol ou acetona (Diferenciação). Aqui as Gram+ retêm cristal violeta, pois pensa-se que o álcool encolhe os poros do peptidoglicano (espessa camada), fazendo com que estas retenham a coloração, mantendo-se arroxeadas; enquanto que as Gram- perdem-no e ficam incolores porque tem peptidoglicano muito fino e poros mais largos, sendo o cristal violeta removido. 4- Coloração com outro corante para corar as Gram- (ficam vermelhas).

O peptidoglicano não é corado. Forma como que uma barrira permeável que previne a perda do cristal violeta.

Algumas espécies como as mycobacterium spp. Não coram com coloração de Gram, pois tem parede celular diferente (altamente rica em lípidos, com uma zona hidrofóbica enorme, não permitindo facilmente a entrada de nutrientes), têm por isso de ser coradas com tratamento forte pela Coloração de Ziehl-Neelsen. Esta usa corante

bastante

concentrado

de

fucsina que entra na parede celular com ajuda do calor. Depois é feita lavagem e diferenciação com ácido clorídrico (forte devido á elevada

1 Parede celular do mycobacterium spp.

concentração lipídica da parede). Aqui algumas permanecem vermelhas e as que são descoradas sofrem depois coloração de contraste com o azul de metileno, ficando azuis. Este método é usado para identificar bactérias da tuberculose e da lepra. Existem também os micoplasmas que não têm parede celular (como tal, os antibióticos que actuam na parede ficam sem efeito), sendo por isso polimórficos. Estes

têm

esfenóis

na

membrana

citoplasmática que protegem a célula das

diferenças osmóticas do exterior, repelindo a água (tem membranas plasmáticas mais fortes e resistentes).

Componentes externos à parede celular Há uma variedade de estruturas cuja função é a protecção, ligação aos objectos e movimento celular. Cápsula, slime layers e S-layers Algumas bactérias têm uma camada de material por for a da parede celular. Quando a camada é bem organizada e não facilmente removida é chamada cápsula. Slime layer é uma zona difusa e desorganizada de material que é facilmente removido. Glicocalixe é uma rede de polissacáridos que se estende da superfície das bactérias e outras células e é produzido por elas, podendo ter vários tipos de bactérias lá dentro. Cápsulas

e

slime

layers

são

compostos por polissacarídeos e polipéptidos. As cápsulas são claramente visíveis ao microscópio óptico quando são empregues colorações negativas (com nigrosina). Funções da cápsula: - Não é necessária ao crescimento bacteriano; - Protege contra a fagocitose; - Contém uma boa quantidade de água, protegendo a bactéria contra a desidratação (efeitos de dissecação); - Aderência a superfícies; - Protecção de ataque de agentes antimicrobianos, sendo mais difícil entrar antibióticos; - Pode ser factor de virulência.

Muitas bactérias Gram+ e Gram- tem camadas regulares e estruturadas chamadas S-layer (modelo de azulejo, composto por proteínas ou glicoproteínas) na sua superfície. Nas Gram- a S-layer adere directamente á membrana externa enquanto que nas Gram+ está associada ao peptidoglicano. Funções da S-layer: - Protege a célula contra alterações iónicas e de pH, stress osmótico e enzimas; - Ajuda a manter a forma e rigidez do envelope (a designação de envelope engloba a membrana plasmática + parede celular e cápsula quando presente); - Pode promover a adesão a superfícies; - Parece proteger os patogenes contra o ataque do complemento e fagocitose, contribuindo para a sua virulência.