Aula 19 Sebenta De Bactereologia

AULA Nº 19 Resistência aos Antibióticos O uso massificado dos antibióticos conduziu ao aparecimento de estirpes bacterianas multi-resistentes aos mesmos. A multi-resistência consiste na resistência de uma bactéria a um conjunto de antibióticos.

Definição De um modo geral, a resistência antibiótica caracteriza-se pela capacidade de uma bactéria resistir aos efeitos de um antibiótico. Existem duas definições diferentes para resistência aos antibióticos:

 Definição Terapêutica Uma estirpe é resistente quando a concentração de antibiótico que ela é capaz de suportar é elevada que a concentração que se pode atingir in vivo. Isto é, a bactéria torna-se resistente quando a concentração mínima inibitória (CMI) não é suficiente para a matar.

 Definição Microbiológica Uma estirpe é resistente quando é capaz de suportar uma concentração de antibiótico mais elevada do que aquela que é capaz de inibir o desenvolvimento da maioria das estirpes da mesma espécie. Por exemplo, se dentro de uma espécie tivermos 100 bactérias sensíveis e apenas uma resistente, esta última é resistente a nível microbiológico uma vez que esta classificação se aplica apenas a uma estirpe e não às outras suas semelhantes.

Tipos 1. Resistência natural Característica presente em todas as estirpes da mesma espécie. Algumas bactérias conseguem ganhar resistência sintetizando os próprios antibióticos que são criados para as inibirem. Outras bactérias podem ainda ter este tipo de resistência por ausência do sistema de transporte ou o alvo do antibiótico. 1

Por exemplo, as espécies Gram negativas são resistentes à vancomicina porque o seu elevado

peso

molecular

e

hidrofobia

não

permitem a sua difusão através da membrana externa da parede celular bacteriana, via canais de porina. Esta membrana externa estabiliza a permeabilidade da barreira plasmática contra o Figura 19.1 – Resistência natural

antibiótico.

das bactérias Gram negativas 2. Resistência adquirida Característica que só aparece em algumas estirpes duma dada espécie normalmente sensível. Este tipo de resistência refere-se às estirpes que no seu estado selvagem eram susceptíveis a um dado antibiótico e que devido à utilização de antibióticos passaram a ser resistentes a antibióticos. As resistências adquiridas podem ainda ser divididas em: •

Resistência por mutação cromossómica

•

Resistência por aquisição de genes

•

Resistência por rearranjos intra-moleculares no DNA

Modificações genéticas

 Resistência por mutação cromossómica Caracteriza-se pela alteração de uma sequência genómica e, consequentemente, o antibiótico deixa de reconhecer o sítio onde se liga normalmente. É geralmente simples, atinge apenas um antibiótico, porque dificilmente uma bactéria sofre mutações simultaneamente para dois ou mais antibióticos. Pode ser de dois tipos: Alteração dos alvos onde o antibiótico actua Exemplos: - PBP (Proteína de ligação à penicilina) girase Os antibióticos β-lactâmicos inibem as PBPs na parede celular bacteriana. As PBPs são então o alvo destes antibióticos e, por isso, qualquer

alteração

na

sua

conformação

implicará

o

não

reconhecimento do sítio onde o antibiótico normalmente se liga. - ARN polimerase 2

- Proteínas ribossomais Se a sequência de RNA for alterada também não será reconhecida pelo antibiótico. Nestes casos, a resistência é limitada a antibióticos do mesmo grupo, isto é, normalmente se é resistente a um dado antibiótico também é resistente aos seus semelhantes. Alteração dos canais de transporte dos antibióticos Os canais de transporte são proteínas, normalmente porinas localizadas na membrana externa das Gram negativas, através dos quais entram metabolitos. Assim, se estas forem alteradas, os canais deixam de ser permeáveis ou específicos para certas substâncias (por exemplo, os antibióticos). Exemplos: - K. Pneumoniae (bactéria gram negativa) - Ácido nalidíxico - Cloranfenicol

Antibióticos

- Trimetoprim

A pressão selectiva exercida pelos antibióticos promove a sobrevivência das bactérias mutantes (resistentes ao antibiótico) face às bactérias susceptíveis ao antibiótico que são destruídas. Por exemplo, no caso da bactéria causadora de tuberculose existem poucos organismos naturalmente resistentes à Estreptomicina. No entanto, em breve serão estes organismos resistentes que dominarão a população.

 Resistência por aquisição de genes Algumas bactérias adquirem genes (DNA estranho) de outras bactérias vizinhas (naturalmente resistentes). As bactérias vizinhas quando morrem por exemplo, permitem a transferência de uma porção de DNA e a bactéria que o recebe fica então resistente. Os genes adquiridos podem actuar de quatro maneiras diferentes: 1) Diminuição da concentração intracelular do antibiótico Exemplo: Tetraciclina Gene TetA e TetB.

3

(é necessário que o antibiótico já esteja no citoplasma para que os genes sejam activados) 2) Destoxificação do antibiótico Exemplo: β-lactamases e aminoglicosido tranferases. Estas enzimas são produzidas pelas bactérias e actuam contra os antibióticos. 3) Modificação do alvo Exemplo: Eritromicina. Este antibiótico é indutor de metilases. A metilação de adeninas e citocinas faz com que as enzimas já não actuem. 4) Substituição de um alvo sensível por um resistente. Exemplo: Sulfamidas A aquisição exógena de DNA, isto é, a transferência genética bacteriana entre células dadoras e receptores, seguida de recombinação genética, pode ocorrer por 3 processos: Transformação Transferência directa de DNA livre de uma célula dadora para o interior de uma célula receptora. A molécula de DNA após absorção à superfície celular, atravessa a parede celular e a membrana citoplasmática bacteriana. Este tipo de transferência genética é típica entre bactérias lisadas e bactérias competentes viáveis. Figura 19.2 – Transformação

Transdução Transferência

de

material

genético de um dador para um receptor, mediado por um vírus específico de bactérias (fago ou bacteriófago). Quando um fago desencadeia um ciclo lítico (lise da célula dadora), originam- -se fagos

Figura 19.3 – Transdução

4

com DNA bacteriano incorporado no seu genoma. O fago híbrido perde a sua capacidade lítica e quando parasita uma nova célula bacteriana específica incorpora o seu material genético no cromossoma bacteriano. A incorporação de DNA no cromossoma bacteriano faz-se por recombinação e a célula receptora passa a ter novas características, nomeadamente resistência aos antibióticos.

Figura 19.4 – Diferença entre transformação e transdução

Conjugação Transferência

directa

de

material genético entre duas células (dadora

e

receptora)

através

de

contacto físico. Por exemplo, nas bactérias Gram negativo há passagem de um tubo proteico de conjugação (PILI).

Figura 19.5 – Plasmídeo R com genes para resistência a antibióticos 5

Este tipo de transferência genética é mediado por plasmídeos F (plasmídeos de fertilidade), como por exemplo o factor R que contém genes de resistência aos antibióticos. A resistência mediada por plasmídeo R pode ser simples, mas, na maioria das vezes, é múltipla e, por isso, torna a bactéria resistente a dois ou mais antibióticos. A aquisição exógena de DNA por estes 3 processos promove a disseminação de resistência a antibióticos entre estirpes bacterianas da mesma espécie ou de espécies diferentes.

 Resistência por rearranjos intra-moleculares no DNA A maior parte dos genes que conferem resistência aos antibióticos estão localizados em estruturas genéticas móveis, como por exemplo: Transposões o Sequências de DNA de cadeia dupla capazes de promover a sua própria transposição entre plasmídeos, de um plasmídeo para o cromossoma e vice-versa o São constituintes comuns do cromossoma bacteriano, de plasmídeos e de bacteriófagos. Integrões o Elementos genéticos móveis; o Têm genes para a resistência a antibióticos, tal como os anteriores.

Sensibilidade  Sensível Estirpe que pode ser atingida por um tratamento da dosagem habitual por via geral. O tratamento dado ao indivíduo leva à morte da bactéria.

 Resistente A estirpe não pode ser atingida qualquer que seja o tipo de tratamento.  Intermediária (moderadamente sensível ou moderadamente resistente) Estirpe que pode ser atingida por:

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- Tratamento local - Aumento das dosagens por via geral - Concentração fisiologia particular (urina, bílis) Este tipo de bactérias depende das condições do doente e do local onde o antibiótico deve actuar, uma vez que a dosagem não é sempre igual em todas as partes do corpo humano. Assim, nas regiões onde se acumulam muitos metabolitos (rim e bílis) quando existem infecções não devem ser usados antibióticos direccionados a bactérias sensíveis, mas sim antibióticos para bactérias intermediárias pois estes acumulam-se nesses locais (aumentam a sua concentração) e, consequentemente, estas bactérias passam a ser sensíveis. Nestas situações, uma concentração normal de antibiótico não serve, mas basta que esta seja um pouco superior para que já torne a bactéria sensível. Ao mesmo tempo, a bactéria é resistente para uma dosagem um pouco abaixo da necessária para ser sensível e morrer.

Exemplos  Resistência às β-lactaminas Antibióticos que actuam na membrana, não entram na bactéria (com excepção destes, os restantes antibióticos terão de atravessar a parede celular e membrana citoplasmática para exercer a sua função). •

β-lactamases Estas enzimas são as responsáveis pela resistência aos antibióticos β-lactâmicos; Hidrolizam o anel β-lactâmico tornando o antibiótico inactivo; À medida que novos antibióticos (β-lactaminas, neste caso) são usadas, as bactérias vão alterando a conformação das β-lactamases; As bactérias podem ainda produzir enzimas que destroem o núcleo β-lactâmico característico deste tipo de antibiótico.

•

Alteração das PLP (PBP) Estas enzimas são sintetizadas pelas bactérias e são importantes ao nível da síntese do peptidoglicano;

7

Antibiótico não reconhece a estrutura uma vez que há alteração da conformação do alvo; Esta PBP alterada não tem afinidade para os antibióticos β-lactâmicos, mas substitui funcionalmente as PBP clássicas que são inibidas naturalmente pelos mesmos. •

Modificação na permeabilidade da membrana (porinas) Quando há alteração conformacional das porinas, o antibiótico deixa de poder entrar na bactéria; Mutações nos genes Omp (porinas) podem impedir a sua acção.

Figura 19.6 – Exemplo de uma bactéria Gram negativa (com membrana externa)

1

•

Antibiótico passa normalmente pela porina e pelo peptidoglicano;

•

A ligação da penicilina às PBPs é semelhante à reacção antigénio-anticorpo;

8

•

A enzima β-lactamase fica inutilizável e, por isso, não há síntese do peptidoglicano. Consequentemente, a bactéria deixa de ter rigidez e a diferença de pressão osmótica leva à sua lise.

2

•

Bactéria sintetiza enzimas (β-lactamases) que degradam o antibiótico (penicilina);

•

PBPs ficam livres;

•

Bactérias tornam-se resistentes pela produção de β-lactamases.

Esta situação é uma consequência da morte da bactéria numa primeira exposição ao antibiótico.

3

•

Forma de enganar as bactérias

•

Simultaneamente, há adição de antibiótico e uma substância semelhante ao mesmo mas que não é activa;

•

Esta substância (por exemplo, ácido clavulânico) é dada em excesso relativamente ao antibiótico e, por isso, as β-lactamases actuam sobre estas deixando de estarem activas (β-lactamases são “enganadas”);

•

O antibiótico fica livre e vai ligar-se às PBPs (alvo), impedindo assim que haja síntese do peptidoglicano;

•

Consequentemente, bactéria morre. primeirodacaso: Figura 19.7No – Ligação β-lactamina ao receptor PBP o Ligação perfeita entre a βlactamina e o receptor PBP. Bactéria morre. No segundo caso: o Com

a

alteração

da

conformação da PBP, há pouca afinidade e a β-lactamina

solta-se.

Consequentemente,

a

bactéria não morre.  Resistência aos aminósidos

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Antibióticos que actuam dentro da bactéria (a nível do ribossoma). •

Resistência natural Anaeróbios aerotolerantes Para atravessarem a membrana é necessário consumirem energia. Como as

bactérias anaeróbias não têm cadeia respiratória a nível da membrana, não têm maneira de consumir energia e, por isso, são naturalmente resistentes aos antibióticos. Por outras palavras, por falta de transportadores oxidativos, este tipo de bactérias torna-se intrinsecamente resistente aos aminósidos. •

Resistência adquirida Alteração mutacional do alvo do antibiótico (ribossoma) leva ao impedimento da interacção antibiótico-alvo e, consequentemente, não há inibição da síntese proteica pelo antibiótico.

•

Interferência com o transporte do antibiótico Porinas localizadas na membrana externa podem ser alteradas por mutação ou delecção,

impedindo

a

difusão

através

dos

canais

de

porina.

(Impermeabilização da membrana externa). •

Destoxificação enzimática: APH aminosido-fosfotransferase ANT aminosido-nucleotidiltransferase AAC aminosido-acetiltransferase

Estas

enzimas,

localizadas

em

plasmídeos e transposões, vão inactivar enzimaticamente promovendo

a

os sua

antibióticos, acetilação

ou

fosforilação. Quando o antibiótico entra pela

Figura 19.8 – Inactivação dos

primeira vez na bactéria, esta morre. No

aminósidos por acetilases (AAC),

entanto,

aquando

de

uma

exposição

adenilases (AAD) e fosfotransferases

posterior, a bactéria já criou estas enzimas

(APH)

que vão inactivar o antibiótico. (Bactérias passam a sintetizar o próprio antibiótico)

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 Resistência às quinolonas •

Mutação cromossómica Alteração da girase (mutação nos genes gyrA e gyrB); Alteração da topoisomerase IV (mutações no gene parC ou parE)

•

Redução do número de porinas

•

Diminuição da acumulação (Bomba de Efluxo) Também designado de bomba de expulsão; São

normalmente

localizadas

na

translocases membrana

Figura 19.9 – Resistência às quinolonas

plasmática; Diminuição da concentração intracelular por efluxo do antibiótico; Por exemplo nas tetraciclinas, caso esta não esteja em concentração suficiente é enviada para o exterior através desta bomba; O antibiótico não atinge intracelularmente concentração (< CMI) para inibir o crescimento bacteriano. O antibiótico ao atingir a bactéria é enviado através desta bomba para o exterior, uma vez que este não tem concentração suficiente para a matar.

Figura 19.10 – Bomba de efluxo

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 Resistência ao cloranfenicol Antibióticos que actuam como bacteriostáticos, inibindo apenas o crescimento das bactérias. •

Resistência plasmídica

•

Mutação ribossómica Mudança na subunidade 23 do rRNA

•

Resistência enzimática A resistência bacteriana ao cloranfenicol é mediada por uma enzima inactivadora do antibiótico, a cloranfenicol-acetiltransferase que é codificada pelo plasmídio R; Os 2 grupos hidroxilos do cloranfenicol são acetilados pela claranfenicol acetiltransferase, tendo como doador o acetil-CoA; A adição de grupos acetil inactiva o antibiótico.

Figura 19.11 – Reacção da cloranfenicol-acetiltransferase  Resistência às sulfamidas Antibióticos que actuam por competição inibitória com a dihidropteroato sintetase. •

Resistência natural

12

•

Resistência adquirida Mutação

cromossómica:

cromossoma

diminui permeabilidade pelas porinas; Aquisição de plasmídeo; Mutação nos genes que codificam DHPS (dihidropteroato

sintetase)

e

DHFR

(dihidrofolato redutase). •

Hiperprodução de PAB Ácido paraminobenzóico (cofactor) é indispensável para a síntese dos ácidos nucleicos (síntese de folatos); PBA é semelhante estruturalmente à sulfamida, daí que haja competição entre ambos. Assim, se a concentração da sulfamida for superior à do PAB este último fica inactivo e a sulfamida acaba por ocupar-lhe o lugar e a bactéria morre. Pelo contrário, se a concentração do ácido for superior, bactéria fica resistente.

•

Figura 19.12 – Síntese de folatos

Hiperprodução de DHFS (dehidrofolato sintetase) Não é inibida pelas sulfamidas; Esta enzima tem como substrato o PAB. Se a concentração de sulfamida for elevada, a DHFS é inactivada e o PAB continua livre.

•

DHFS mutação resistente A sulfamida não actua sobre esta, daí que haja síntese na mesma de purinas e pirimidinas; Produção de uma forma de dihidropteroato sintetase com baixa afinidade para as sulfamidas, sem alteração na afinidade para o PAB.

•

Plasmídeo DHFS adicional

•

Diminuição de permeabilidade

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 Resistência aos nitrofuranos e nitro-imidazóis Antibióticos que quando em elevada concentração inibem enzimas do ciclo de Krebs, síntese DNA e RNA e síntese total de proteínas. •

Actividade nitro-redutase diminuída Esta enzima permite a passagem de nitrato a nitrito (tóxico) Se a sua concentração estiver reduzida, a bactéria já não forma nitritos e, consequentemente, não há degradação do DNA (resistência)

 Resistência à rifampicina Antibióticos inibidores da síntese de mRNA. •

Resistência por mutação cromossómica Mutação na subunidade β’ da RNA polimerase.

•

Impermeabilização da membrana externa

 Resistência •

Figura 19.13 – Resistência à Rifampicina

à tetraciclina

Resistência por insuficiente concentração intracelular Actividade exagerada da bomba de efluxo; Genes mutantes superexpressam proteínas transportadoras de membrana responsáveis pela entrada e saída de substâncias no meio citoplasmático, fazendo com que a retirada do antibiótico para o meio extracelular seja mais rápida que a sua difusão pela membrana bacteriana, mantendo uma concentração insuficiente dentro da bactéria e deixando de actuar como bloqueador de funções celulares.

•

Impermeabilização da membrana externa das bactérias Gram negativo

•

Mecanismo de efluxo 14

Dependente de Energia; Através de proteínas inseridas na membrana citoplasmática (TetA, B, C, D, E); Mecanismo mais frequente. •

Protecção do ribossoma bacteriano Por proteínas que bloqueiam a ligação da tetraciclina ao ribossoma (TetM, O, S, B e Q).

TetB – Proteína de resistência à tetraciclina TetR – Proteína reguladora/repressora TetR regula a expressão de proteínas resistentes à tetraciclina. A proteína TetR é um repressor da proteína de resistência TetB. Na ausência de tetraciclina: TetR é ligada ao operão tetO2. Na presença de tetraciclina: TetR liga-se à tetraciclina alostericamente e dissocia-se do tetO2, permitindo a expressão das Figura 19.14 – Regulação do efluxo

proteínas de resistência à tetraciclina.

mediada por repressores

Figura 19.15 – Antiporte TetA(B)/H+

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Classes de

Exemplos

Mecanismos de resistência a

antibióticos

antibióticos

Aminoglicósidos

Gentamicina

1. Alteração do alvo

Kanamicina

3. Inactivação do antibiótico

tobranicina Ansamicinas

Fifampicina

4. Efluxo activo

1. Alteração do alvo 2. Redução na permeabilidade celular

Penicilinas

β-lactâmico

Meticiclina

1. Alteração do alvo 3. Inactivação do antibiótico 3. Isolamento de um antibiótico por uma proteína 2. Redução da permeabilidade celular

Fenicóis

Cloranfenicol

4. Efluxo activo

3. Inactivação do antibiótico Glicopéptidos

Vancomicina Teicoplanina Eritromicina

Macrólidos

Claritromicina

1. Alteração do alvo 4. Efluxo activo 1. Alteração do alvo

3. Inactivação do antibiótico 1. Alteração do alvo (DNA girase)

Ácido Nalidíxico

Quinolonas e Fluoroquinolonas

Norfloxacina

2. Defeito da difusão através na membrana externa 4. Efluxo activo 4. Efluxo activo

Sulfonamidas ou

Co-trimonazole

Trimethoprim

1. Hiperprodução do alvo onde antibiótico

Tetraciclina Tetraciclinas

3. Via metabólica alternativa

Minociclina

actua 2. Redução na permeabilidade celular 4. Efluxo activo 1. Alteração do alvo 3. Via metabólica alternativa

Quadro 19.1 – Quadro resumo da resistência a antibióticos

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Avaliação laboratorial  Antibiograma O antibiograma é um teste feito in vitro que mede a resistência ou sensibilidade de uma bactéria específica a vários antibióticos e, assim, permite a determinação de qual o antibiótico mais adequado ao tratamento da doença provocada pela bactéria em estudo. Objectivo •

Analisar o espectro de sensibilidade/resistência a antibióticos de uma bactéria;

•

Determinar a concentração mínima inibitória (CMI). Procedimento

•

Neste teste há a utilização de caixas de Petri com um meio de cultura de gelose (Agar Mueller-Hinton) onde semeamos a bactéria por espalhamento;

•

O antibiótico é impregnado nuns discos de papel de filtro (discos de difusão) colocados na caixa inoculada com a bactéria. Este antibiótico vai difundir-se ao longo do meio de gelose (dispersão em torno de um círculo); Resultados

•

Interpretação da susceptibilidade baseia-se na medida do halo de inibição do crescimento bacteriano formado ao redor do disco;

•

Microrganismos que apresentarem resistência in vitro também serão resistentes in vivo. Por outro lado, microrganismos apresentando sensibilidade in vitro podem ser resistentes in vivo;

•

A formação de um halo transparente sobre a superfície do meio, ao redor de um disco de antibiótico, indica uma região com ausência de crescimento bacteriano, revelando a acção inibitória do antibiótico sobre a bactéria.

17

Zona correspondente à CMI (concentração mínima que

Resistência muito elevada

impede a multiplicação da

(Bactéria cresce junto ao disco)

bactéria)

Diâmetro muito pequeno

A partir deste ponto, a concentração

Concentrações decrescentes Figura 19.16 – Antibiograma

de antibióticos

de

antibiótico

já

não

é

suficiente

para

que

a

bactéria morra

Isto não significa que o antibiótico parou de funcionar Indica apenas que já não é suficiente

Através do antibiograma podemos ainda estabelecer uma relação entre a resistência/sensibilidade da bactéria e o seu diâmetro que pode ser consultado em tabelas.

 Determinação da CMI

Macrométodo •

Série de tubos com diluições sucessivas de antibiótico;

•

Adicionar mesma quantidade de bactérias em todos os tubos;

•

À medida que a concentração de antibiótico diminui, o tubo torna-se turvo (há crescimento de bactérias);

•

Quando a concentração de antibiótico é muito elevada, não existem bactérias;

•

O primeiro tubo com turvação (crescimento bacteriano) visível corresponde ao valor da CMI.

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Bactéria cresce neste sentido porque antibiótico

concentração vai

de

diminuindo

progressivamente (começa a notar-se a turvação)

Figura 19.17 – Determinação da CMI de um antibiótico em meio líquido Micrométodo (Placa de Elisa) •

Pode ser usado para vários antibióticos simultaneamente;

•

Em cada linha aplica-se um determinado antibiótico;

•

Fundamento semelhante ao macrométodo (diluições sucessivas de antibiótico, mesma quantidade de bactéria);

•

Objectivo: determinar CMI.

Figura 19.18 – Micrométodo

Eteste •

Tira de papel colocada na caixa inoculada com a bactéria;

•

Disponível para todos os antibióticos;

•

Esta tira tem um gradiente de concentração (concentrações crescentes de antibiótico) para se determinar quantitativamente a sensibilidade ou resistência de qualquer microrganismo.

•

Objectivo: determinar CMI.

19

Concentração crescente de antibiótico (aumenta o halo à volta da tira)

Bactéria não cresce nesta zona (concentração de antibiótico elevada)

CMI – Ponto de intersecção entre zona de inibição e a escala da tira. A partir desta zona a bactéria cresce Figura 19.19 – Determinação da CMI por Etest

Bibliografia usada para a aula nº19: Slides das Teóricas Prescott, Harley, and Klein’s MICROBIOLOGY, de Joanne M. Willey, Linda M. Sherwood e Christopher J. Woolverton, Edição Internacional – 7ª edição, McGrawHill, Cap. 34 Antibióticos Anti-bacterianos, João Carlos de Sousa, Publicações Farmácia Portuguesa, Associação Nacional de Farmácias – 1ª Edição, Cap. 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 17, 18 e 19 (Livro recomendado pelo professor que deu a respectiva aula teórica) www.textbookofbacteriology.net

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