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Extracción de timol y carvacrol a partir de la planta de tomillo (Thymus Vulgaris) por hidrodestilación asistida por microondas y evaluación de su capacidad microbiana Arango Zapata, J.P, Galeano Muñoz, J.A, Muñoz Cabarico, G.A. Resumen:

Abstract:

1. Introducción: Los aceites esenciales se han utilizado ampliamente en todo el mundo y su uso aumenta constantemente debido a la gran demanda de ingredientes naturales en muchos campos. Por lo tanto, se producen grandes cantidades de aceites esenciales para suplir las industrias de saborizantes, fragancias, cosméticos, y sus diversas aplicaciones en medicina [1,2]. El tomillo (Thymus vulgaris) es un subarbusto cos tallos erguidos, cuadrangulares, leñosos y muy ramificados. Las hojas son pequeñas y ovales de bordes enrollados y sus flores son pequeñas de color rosa. Muchos experimentos farmacológicos in vitro realizados durante las últimas décadas han mostrado que el aceite esencial de tomillo y los extractos de plantas presentan ciertas actividades farmacológicas [3] y se ha demostrado que posee propiedades antibacterianas, antifúngicas, antivirales, insecticidas y propiedades antioxidantes [4], algunos aceites han sido utilizados en el tratamiento para el cáncer [5], mientras que otros se han utilizado en la conservación de alimentos [6], aromaterapia [7] e industrias de fragancias [8]. El tomillo ha sido una planta de usos múltiples y que tradicionalmente además de usarse como condimento se ha empleado para el dolor de garganta, la laringitis, tos seca, tos ferina, acné, bronquitis y antidiarreico, además, posee propiedades antiinflamatorias y antisépticas sobre ulceras y heridas [9]. La mayor parte de la actividad antimicrobiana de especias y hierbas culinarias parece estar asociada con compuestos fenólicos derivados de aceites esenciales tales como timol, carvacrol, eugenol, linalool y p-cimeo pues todos ellos inhiben una variedad de microorganismos [10]. Estudios han publicado que el componente con el espectro más amplio es el timol seguido de carvacrol, donde este último, además de presentar actividad bactericida, se ha caracterizado como inhibidor de crecimiento de diferentes patógenos [11, 12]. Un aceite esencial puede tener cientos de componentes químicos individuales, y su composición puede variar debido a los factores que afectan el ambiente de la planta tales como ubicación geográfica, tipo de suelo, condiciones climáticas entre otras [13]. En la tabla 1 [14] se aprecian los compuestos químicos presentes en el timol con su respectiva composición porcentual. El monoterpeno más abundante corresponde al pcimeo, y los terpenoides fenólicos presentes en mayor proporción son el timol y el carvacrol, además contiene algunos flavonoides [15-18]. Entre los estudios publicados se ha encontrado que el timol y el carvacrol en conjunto, poseen una gran actividad antimicrobiana in vitro contra un amplio espectro de bacterias grampositivas [19]. Existe

una amplia gama de técnicas instrumentales disponibles para el análisis de los aceites esenciales (por ejemplo, análisis físico, organoléptico, químico, cromatográfico y espectroscópico), que en su conjunto son de gran utilidad a la hora de separar, analizar y caracterizar los extractos [20]. Tabla 1. Componentes volátiles identificados en el aceite esencial de tomillo

2. Materiales y métodos Material vegetal La planta de tomillo fue adquirida en la plaza minorista de la cuidad Medellín. Proceso de extracción Se lava la planta con agua del grifo para eliminar impurezas y se corta finamente el total de esta (tallo y hojas), se procede a introducir el material vegetal a un balón con agua

desionizada y posteriormente al microondas donde se realiza el montaje indicado en la figura 1. Figura 1. Extracción de aceites esenciales de tomillo por hidrodestilación asistida por microondas

Hidrodestilación asistida por microondas Una vez realizado el montaje se programa el equipo para el calentamiento durante 1 hora a una potencia del 70%. Terminado el calentamiento se recoge el aceite cuidadosamente del aparato de Clevenger y se procede a extraer el agua con un agente secante (sulfato de sodio anhidro). Separación y caracterización El aceite obtenido se le realizó un análisis por cromatografía en capa fina para ver el grado de complejidad de los analitos constituyentes, para tal fin se tomó una pequeña cantidad de este, se solubiliza en cloroformo y se siembra en placas cromatográficas de silica gel se utilizó diclorometano como fase móvil. La placa cromatográfica obtenida la podemos ver en la figura 2. Figura 2. Placa cromatográfica del aceite esencial obtenido empleando diclorometano como fase móvil

Posteriormente se procede a separar el aceite de acuerdo al grado de polaridad de los compuestos constituyentes, para tal fin se utilizó la cromatografía de columna. La muestra de aceite se disuelve en 20 mL de cloroformo, se lleva al rotoevaporador hasta secar casi totalmente el solvente (CC), una vez empacada la columna con silica gel usada como fase estacionaria, se vierte esta mezcla (CC) en la parte superior de la columna y se procede a eluir la muestra con un gradiente de polaridad iniciando con hexano y terminando con diclorometano tal y como se aprecia en la tabla 2. Tabla 2. Gradiente de solventes empleados como fase móvil Hexano 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Diclorometano 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Volumen (mL) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Se recolectaron fracciones cada una de aproximadamente 10 mL en tubos de ensayo y posteriormente se les realizo TLC con el fin de juntar las alícuotas que presentaran el mismo perfil de manchas en las placas. En total se obtuvieron tres fracciones totales. Cada una de ellas se roto evaporo y se almaceno en recipientes sellados aislados de la luz en una atmosfera inerte de N2 para análisis posteriores.

Para la caracterización de los compuestos obtenidos se utilizó espectroscopía IR, no se contaba con un patrón de Timol y Carvacrol por lo cual se recurrió a espectros reportados en la literatura para la asignación de bandas. En la figura 3 observamos el espectro IR correspondiente a la fracción de interés, y en las figuras 4 y 5 apreciamos los espectros reportados en la literatura para el timol y el carvacrol respectivamente. Figura 3. Especto IR de la fracción número tres

Figura 4. Espectro IR estándar del Timol

Figura 5. Espectro IR estándar del carvacrol

Determinación de la actividad bactericida Se determinó la actividad bactericida de las tres fracciones obtenidas mediante la preparación de soluciones al 5% en DMSO y posterior evaluación en sepas de bacterias Gram +/-. Se utilizó como control Oxytetraciclina, antibiótico de amplio espectro empleándose el método de difusión en agar. En este método se utilizaron discos de papel filtro impregnados con las soluciones antes mencionadas. Después de la siembra se incubaron las cajas de petri por 24h a 35°C. Se evaluaron las bacterias Staphylococcus aureus (Gram +) y Escherichia coli (Gram -), cuya sensibilidad a los compuestos extraidos se determinó por la medición del halo de inhibición alrededor del disco, presentándose esté como una zona clara que se difunde radialmente.

3. Resultados y discusión Una vez obtenidas las tres fracciones de la columna se les realizó cromatografía de capa fina a cada una de ellas con el fin de obtener un valor de Rf y poder realizar comparaciones con estudios previamente publicados. En la figura 7 observamos las tres placas cromatográficas obtenidas con sus respectivos valores de Rf, la fase móvil empleada fue diclorometano.

Figura 6. Placas cromatográficas obtenidas de cada fracción de la columna

La primera fracción en salir mostro un valor de Rf de 0,91 y la segunda un valor de 0,97. Si comparamos estos valores con los obtenidos en la TLC realizada al aceite esencial puro (Figura 2) notaremos que corresponden a los dos compuestos que se encuentran en la parte superior respectivamente porque sus valores de Rf son prácticamente iguales. La tercera fracción tuvo un Rf de 0,66 lo cual corresponde a la mezcla de timol y carvacrol, ya que este valor es aproximadamente igual al promedio de los Rf de las dos manchas mas bajas obtenidas del aceite esencial puro (Figura 2). [21] Con el fin de caracterizar mejor la tercera fracción obtenida se decidió realizarle un espectro IR para determinar que grupos funcionales estaban presentes. Se puede observar en la figura 3 que entre 3050-2990 cm-1 están presentes señales debido a tensiones C=C sp2 de anillos aromáticos, entre 2990-2890 cm-1 tensiones C-C sp3 característicos de grupos metilos, en 1244 cm-1 flexiones -CH2-, en 1250 cm-1 tensión C-O, en 738 cm-1 flexiones fuera del plano característicos de compuestos aromáticos. Llama la atención la banda característica de alcoholes -OH entre 3500-3200 cm-1 ya que en los estándares presenta una banda muy pronunciada (Ver figuras 4 y 5) pero en la muestra esta se ve muy tenue. Cabe resaltar que el espectro infrarrojo fue tomado por la técnica ATR, y esta tiende a atenuar las señales obtenidas y que probablemente la concentración de timol y carvacrol sea muy baja, sin embargo, comparando los tres espectros, podemos observar una gran correspondencia entre la mayoría de las bandas, y teniendo en cuenta los valores de Rf obtenidos, da pie a concluir que la tercera fracción tenía una composición mayoritaria de timol y carvacrol. En la tabla 3 se muestran las bandas más características en el IR para el timol y el carvacrol [22].

Tabla 3. Bandas características del timol y carvacrol en el IR Compuesto

Timol

Carvacrol

Estructura

Bandas características en el IR 3250-3300 cm-1: Tensión de O-H 3103-3000 cm-1: Tensión C-H de aromático 2867 cm-1: Tensión simétrica de C-H3 2962 cm-1: Tensión antisimétrica de -CH3 1458-1419 cm-1: Flexión de O-H en el plano 1244 cm-1: Flexión de C-H 738 cm-1: Flexión fuera del plano de C-H 3382 cm-1: Tensión de O-H 2960-2868 cm-1: Tensión de alcano ramificado C-H 1359 cm-1: Flexión del grupo isopropilo 1458 cm-1: Flexión de C-H 1251 cm-1: Tensión de C-O 1585-1458 cm-1: Tensión de anillo de C-C

El timol y el carvacrol son compuestos presentes en ciertos aceites esenciales de plantas, el tomillo es una de ellas. En la estructura de estos componentes se reconoce un grupo fenólico con alto grado hidrófobo, esta particularidad les permite permear membranas externas celulares, resultado esto es la salida de lipopolisacáridos e incremento de la permeabilidad de está provocando consecuentemente la salida de ATP, inhibición de ciertas proteínas y disminución de la fuerza motriz del protón.

Se han realizado estudios demostrando que el timol y el carvacrol interactúan con la membrana celular disolviéndose en bicapa lipídica provocando una distorsión de la estructura física de esta que puede causar desestabilización. Análisis de potencial celular antes y después de adicionar timol y carvacrol han demostrado que estos componentes provocan una fuerte disminución de la fuerza motriz de protón, esto se ve reflejado en los niveles intracelulares de potasio que disminuyen mientras los extracelulares aumentan, esto hace pensar que estos compuestos son capaces de abrir canales a través de la membrana permitiendo el flujo de iones desde el citoplasma hacia el exterior. Se han hecho estudios que las E. coli Burt et. Al (2007) que crecen en presencia de timol y carvacrol a una concentración 1Mm presentan un movimiento restringido, ya que esta utilizaría su energía en otras funciones vitales diferentes a generar flagelos, al aumentar la concentración a 5Mm esta no presenta movilidad y se produce su muerte. La intoxicación alimentaria causada por Escherichia coli son un problema emergente tanto en los países en desarrollo como en los desarrollados. Los ensayos convacrol y timol con

este tipo de bacterias han mostrado un amplio espectro muy efectivo para la eliminación de microorganismos tanto en gram positivos y gram negativos. Algunos antibacterianos derivados naturalmente, como los aceites esenciales muestran una actividad antimicrobiana deseada al inhibir el crecimiento de Staphylococcus aureus (Gram +) y Escherichia coli (Gram -). Determinación de la actividad antimicrobiana Para evaluar la capacidad antimicrobiana de las fracciones se utilizó el método de difusión en agar y determinó la actividad bactericida de las tres fracciones obtenidas. La actividad antimicrobiana del carvacrol y el timol fue evalúa contra dos cepas de bacterias, una grampositiva correspondiente a Staphylococcus aureus y otra gramnegativa como Escherichia coli. Las muestras se prepararon eliminando el solvente original por rota evaporación y redisolviendo los extractos en aproximadamente preparación de soluciones al 5% en DMSO. Después de la siembra se incubaron las cajas por 24h a 35°C. Una vez los discos se ponen en contacto con la superficie del agar, el antimicrobiano se difunde desde el disco en forma radial. La sensibilidad de las bacterias usadas en este ensayo se midieron al observar una zona (halo) de inhibición de crecimiento alrededor del disco. Se usó entonces una regla para medir la zona clara alrededor del disco de antimicrobiano. El primer factor que se selecciona cuando se lleva a cabo una prueba de susceptibilidad antimicrobiana es el medio de cultivo, para cepas de bacterias no exigentes como la E. Coli y la S. Además de esto, para llevar a cabo las pruebas de actividad antimicrobiana existen una variedad de métodos que pueden ser utilizados para medir la susceptibilidad in vitro a los antimicrobianos. Uno de los métodos más utilizados en microbiología, es el Kirby-Bauer o prueba de difusión en disco, porque a pesar de que solo brinda información cualitativa a semicuantitativa, es sencillo, fácil de realizar y los resultados obtenidos son de gran valor, ya que a partir de ellos se puede iniciar, mantener o modificar una antibioticoteprapia. Los resultados obtenidos para las pruebas antimicrobianas de muestran en la Figura 7, además de esto se muestra el resultado correspondiente a la prueba llevada a cabo con un antibiótico correspondiente a la oxitetraciclina.

Figura 7.

Actividad antimicrobiana donde: B Cultivo con cepas S. Aureus usando los todos los extractos. A Cultivo con cepas E. Coli

La resistencia bacteriana es un problema antiguo, pero de gran actualidad, ya que se tiene un menor desarrollo de nuevas moléculas de antibiótico, pero la presencia de microorganismos multirresistentes es cada vez más frecuente. El S. Aureus es el mayor patógeno humano causante de infecciones a la piel y tejidos, neumonía, septicemia e infecciones por dispositivos asociados. Así mismo, la E. Coli tiene altos porcentajes de resistencia hacia ampicilina, trimetoprim sulfametoxazol, tetraciclina, cloramfenicol y ácido nalidíxico, lo que supone grandes complicaciones en el tratamiento antibiótico cuando este es requerido. Este aumento de resistencia antibiótica se debe a la adquisición de diferentes mecanismos moleculares de resistencia mediante mutaciones puntuales a nivel cromosómico. Actualmente se busca encontrar alternativa a los tratamientos con antibióticos usando los productos naturales, ya que se ha reportado que las bacterias presentan menor resistencia a este tipo de compuestos. Usando el método de difusión en disco se encontró que los microorganismos evaluados pueden presentan un crecimiento confluente alrededor del disco, (se presenta halo de inhibición) en ambos cultivos, el cual es comparable con el antibiótico correspondiente a la oxitetraciclina (control positivo). se observaron zonas de inhibición considerables, esto indica que estos extractos presentan una actividad antimicrobiana representativa contra la S. Aureus y la E. Coli. Cuando se presenta una zona de inhibición clara en la que se puede medir el halo, se puede afirmar que hubo inhibición, este comportamiento se evidenció principalmente en la fracción M16 (B) Cultivo con cepas de Staphylococcus aureus (Gram +) usando los todas las fracciones lo cual concuerda con lo dicho anteriormente que se encontró reportado en estudio, donde se dice que el timol y el carvacrol en conjunto, poseen una gran actividad antimicrobiana

in vitro contra un amplio espectro de bacterias grampositivas, además se sabe que esta fracción es la que se creía inicialmente que tenía dichos compuestos y con ayuda del espectro IR se confirmó, como prueba adicional la Determinación de la actividad antimicrobiana por medio de la presencia de los halos de inhibición ayuda a tener más información. Los dos cultivos presentan halos de inhibición tanto para M1,M16 y M31, lo cual nos indica que los extractos obtenidos presentan actividad antimicrobiana, se pudo confirmar que la M16 es la que contiene carvacrol y timol, las demás fracciones pueden contener los demás compuestos que se mencionaron inicialmente en la tabla 1, pero que no son parte del estudio. Pero el comportamiento evidenciado de M16 con respecto a oxitetraciclina (control positivo) en el cultivo con cepas de Staphylococcus aureus (Gram +) es considerable, se encuentra que el antibiótico aún tiene menor capacidad para inhibir el crecimiento de estos dos tipos de cepas bacterianas, por cual se debe trabajar en el aislamiento de metabolitos con mayor capacidad antimicrobiana que puedan igualar o superar a los antibióticos.

4. Conclusiones Se logro identificar por medio de un espectro infrarrojo que se obtuvo el timol en la fracción 3 nombrada como (M16), por medio de una separación por columna utilizando diferentes gradientes de hexano y diclorometano y diferentes ensayos con solventes en cromatografía de capa fina y se logró una separación de los compuestos, además se obtuvieron valores de Rf y así se pudo realizar comparaciones con estudios previamente publicados. Las 3 fracciones presentaron actividad antimicrobiana en ambas cepas, esto pudo deberse a que los compuestos presentes en ellos tienen la capacidad de interactuar con la membrana plasmática de la bacteria e inhibir su crecimiento. La actividad antimicrobiana encontrada en estos extractos es comparable con el control positivo que se utilizó en este caso el antibiótico, ésta no se compara aun con el antibiótico (oxitetraciclina). el cual presenta una actividad mucho menor cuando se compara con (M16) correspondiente a la fracción 3. Se encontró una mayor capacidad de inhibición en la muestra 3 (M16) en cultivo con cepas Staphylococcus aureus (Gram +) y además con un porcentaje de inhibición mayor en comparación que el control positivo (oxitetraciclina). Las demás fracciones (M1) y (M31) también mostraron una capacidad de inhibición apreciable. En el cultivo con cepas Escherichia coli (Gram -) las fracciones (M31), (M1) y (M16) mostraron capacidad de inhibición apreciable, pero la (M16) correspondiente a la tercera fracción es la que presenta un mayor porcentaje de inhibición en comparación con el control positivo (oxitetraciclina). Cabe resaltar que la fracción nombrada (M16) es donde se tenía la hipótesis sobre si esta contenía los compuestos de estudio en el aceite esencial que se obtuvo, el carvacrol y el timol lo cual nos da más información para confirmarlo.

5. Agradecimientos Al Grupo Interdisciplinar de Estudios Moleculares (GIEM) donde se realizaron los ensayos bacterianos. Al monitor del laboratorio de química orgánica por facilitarnos los materiales necesarios para los ensayos. A los profesores Víctor Villa y Carlos Peláez por la asesoría brindada y el constante acompañamiento.

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