VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA Mini – curso XIII ENCONTRO NACIONAL SOBRE METODOLOGIAS DE LABORATÓRIO
Instrutora: Margareth Westin Duarte de Azevedo
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA- aspectos conceituais • A validação é a confirmação, por exame, e fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos para um determinado uso pretendido, são atendidos (ABNT NBR ISO 8402:1994).
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
2
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - aspectos conceituais • A validação de um método analítico pode ser interpretada como o processo de definir os requisitos analíticos para um dado uso específico e de confirmar que o método tem capacidade de desempenho consistente com o que sua aplicação requer, incluindo, portanto, o processo de estabelecimento das características de desempenho e o julgamento de sua adequação para um fim específico. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
3
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - aspectos conceituais • A definição dos requisitos analíticos deve considerar características como o tipo de resposta que está sendo solicitada, se o analito está disperso ou concentrado, qual o nível de interesse, com qual exatidão e incerteza a medida deve ser fornecida, qual a matriz, qual o tamanho da amostra, se o resultado deve atender a especificações externas, entre outras. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
4
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICAconsiderações técnicas • Validam-se métodos não padronizados, métodos internos, métodos padronizados utilizados fora de seu escopo pretendido, e ampliações ou modificações de métodos padronizados, para confirmar que estes métodos são adequados para o seu uso pretendido.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
5
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICAconsiderações técnicas • Quando é utilizado um método normalizado, considera-se qual o grau de proximidade das condições de implantação, se dados de validação declarados são adequados ao propósito e se o laboratório é capaz de alcançar o nível de desempenho.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
6
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICAconsiderações técnicas • A extensão de validação e revalidação vai depender da natureza das alterações feitas na reaplicação de um dado método em diferentes laboratórios, da instrumentação, dos operadores e das circunstâncias nas quais o método é aplicado.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
7
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICAconsiderações técnicas • A validação deve ser tão extensa quanto for necessário para alcançar as necessidades de uma determinada aplicação, num dado campo. Nesse contexto, a validação poderá incluir procedimentos de amostragem, manuseio e transporte. Para a validação existe sempre um balanço entre custos, riscos e possibilidades técnicas. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
8
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICAconsiderações técnicas FUNDAMENTO PRINCIPAL • Algum grau de validação é sempre apropriado.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
9
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICAconsiderações técnicas • Caminhos que o laboratório deve seguir quanto à confirmação dos seus resultados – métodos não normalizados – Analisar se o método é modificado, adaptado, utilizado fora de seu escopo inicial ou novo (outro método diferente em fundamento ou em execução dos normalizados para o analito) – Em princípio, esses métodos necessitam de validação completa – Assegurar descrição detalhada do método – Definir metas em função do uso pretendido – Assegurar recursos completos para execução – Definir principais características de desempenho a avaliar – Definir programa experimental e de tratamento de dados – Conduzir o programa e avaliar os resultados em relação às metas MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
10
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICAconsiderações técnicas Princípios da confirmação e da validação de métodos • Em ambas as situações, a comprovação da capacidade do laboratório resulta da – da avaliação experimental interna de metodologias – segundo plano experimental próprio – conduzida sob orientação principal de referências e documentos orientativos internacionais – produzindo dados tratados sob a orientação de tais documentos e resultados interpretadas pelo laboratório. – tal confirmação interna pode ser complementada por comparações interlaboratoriais.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
11
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICAconsiderações técnicas • As validações podem ser conduzidas internamente nos laboratórios e com estudos interlaboratoriais cooperativos. • Podem ainda ter os dois processos combinados • Métodos novos devem sofrer também processo de validação interlaboratorial.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
12
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - Pré-condições • Antes de iniciar um processo de validação o laboratório deve dispor dos recursos integrais necessários, tais como equipamentos calibrados, materiais de referência, normas e outros documentos orientativos, descrição preliminar do método, noções de consumo de padrões e de amostras de matrizes, planejamento experimental e de tratamento de dados, noções de níveis de aceitabilidade. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
13
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - Pré-condições • Em sua primeira etapa, os requisitos analíticos devem estar o melhor possível definidos, o método deve ser registrado em um procedimento de ensaio e os estudos para determinar os parâmetros de desempenho deste devem ser realizados com equipamentos e instrumentos dentro da especificação, funcionando corretamente, adequadamente calibrados e metrologicamente controlados. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
14
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - Pré-condições • O operador que realiza os estudos deve ser competente na área de estudo e tem que ter conhecimento suficiente sobre o trabalho e ser capaz de tomar as decisões apropriadas durante a realização do estudo. • A equipe deve ter domínio sobre o experimento, o método, as variáveis e os resultados. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
15
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – procedimento do estudo Procedimento de como conduzir um estudo • Escrever o procedimento original • Tentar estabelecer o nível de qualidade desejado para o método • Estabelecer um plano de execução do estudo • Realizar ensaios de confirmação de desempenho • Interpretar resultados • Escrever o procedimento com as condições de otimização definidas • Armazenar os resultados de experimentos e tratamento de dados • Atentar-se para o registro da rastreabilidade de equipamentos, reagentes e soluções (origem) MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
16
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – procedimento do estudo Outras condições essenciais • Brancos, brancos de reagentes ou amostras • Amostras reais • Materiais fortificados com o analito ou spiked com interferentes • Padrões • Materiais de Referência e Materiais de Referência Certificados • Estatística e replicações MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
17
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – procedimento do estudo Condição essencial: aplicação da Ferramenta fundamental - Estatística – Relembrar conceitos e aplicações – Compreender os testes, experimentos e os resultados
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
18
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICAcaracterísticas de desempenho • Principais características de desempenho de um método e seu significado – especificidade e seletividade – faixa de trabalho e linearidade – limites de detecção e de quantificação – sensibilidade – indicadores de dispersão – exatidão – robustez . incerteza MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
19
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICAcaracterísticas de desempenho • O estabelecimento dessas características para um determinado método deve seguir um desenvolvimento experimental apropriado e um tratamento estatístico adequado.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
20
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - especificidade e seletividade • • • •
Literatura: divergência sobre os conceitos de especificidade e seletividade. Estão relacionados à capacidade do método em distinguir um analito numa dada matriz. Um método que produz resposta para apenas um analito pode ser chamado específico. Um método que produz respostas para vários analitos, mas que pode distinguir a resposta de um analito da de outros, pode ser chamado seletivo Avalia o efeito de interferentes e a detecção específica do método. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
21
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - especificidade e seletividade • Tipos de experimentos dependem – da disponibilidade do analito – da matriz sem o analito – de amostras de referência.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
22
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - especificidade e seletividade • Se a matriz da amostra sem analito ou amostras de referência estiverem disponíveis: – selecionar a matriz livre do analito – escolher cerca de três faixas de concentração de interesse – selecionar um material de referência ou padrão de procedência reconhecida e preparar uma solução estoque de concentração compatível com a adição que se pretende efetuar – preparar no mínimo sete provas de branco do método para cada concentração escolhida – preparar no mínimo sete provas de matriz do método para cada concentração escolhida – adicionadar padrão em concentrações equivalentes no branco e na matriz para obter as concentrações de interesse.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
23
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - especificidade e seletividade – – – – –
– matriz da amostra sem analito(continuação) analisar todas as provas do segundo o procedimento descrito para o método. Para cada grupo de branco adicionado e de amostra adicionada, em cada concentração calcular as variâncias e efetuar um teste F para verificar se as variâncias são homogêneas em função do resultado do teste F, escolher o teste t apropriado para comparação das médias de cada grupo. Efetuar o teste t para homogeneidade de médias.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
24
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - especificidade e seletividade Especificidade e Seletividade •
• • • • •
Os efeitos de matriz podem ser avaliados ainda pelos desvios relativos ou absolutos em relação aos valores conhecidos ou de referência (resultado de método ou de amostra de referência) analisados graficamente plotando-se as diferenças em função da concentração observando-se a presença de aleatoriedade ou tendências ao longo da faixa analisada. xi=resultado da amostra; xrefi=resultado da análise de uma amostra de referência.
xi − xrefi dri = x100 xrefi
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
25
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - especificidade e seletividade • No caso de matriz com o analito podem ser comparadas inclinações de curvas de calibração – preparar duas séries de amostras com a adição da mesma concentração do analito em cada nível de concentração – uma das séries contém a matriz e portanto um nível básico do analito. – plotar resultados das duas séries num mesmo gráfico, em função da concentração do analito adicionado, – verificar se as inclinações forem as mesmas, o que significa que a diferença entre essas curvas é devida ao nível básico do analito originalmente presente. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
26
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - especificidade e seletividade • Devem ser considerados também fatores que são característicos de seletividade/especificidade para uma técnica. – Exemplo: No caso de cromatografia: comparação visual de cromatogramas, resolução, tempo de retenção, entre outros.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
27
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA Faixa de trabalho e linearidade – Faixa de trabalho (Eurachem): limitada pelos limites de detecção/quantificação e pelos fatores impostos pela resposta do sistema instrumental. Nesta faixa pode existir uma faixa de resposta linear. – Faixa útil de trabalho (Taylor): É aquela situada entre o limite de quantificação e o de linearidade.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
28
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA Faixa de trabalho e linearidade – ISO 8466-1:1990 − Calibração e avaliação de métodos analíticos e estimativa das características de desempenho: Parte 1 - Avaliação estatística da função linear de calibração – Figuras de mérito* são relacionadas ao desempenho do método • • • •
*determina-se a faixa de trabalho *desvio padrão residual (Sy) *desvio padrão do método (Sx0) *coeficiente de variação do método (Vx0).
– Pela Norma, pode-se ainda obter o intervalo de confiança para amostras interpoladas.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
29
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA Faixa de trabalho e linearidade • A faixa de trabalho é definida pela Norma como o intervalo, determinado experimentalmente e validado estatisticamente, entre a menor e a maior concentração de calibração do método analítico. • Ver Exemplo de determinação
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
30
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA Faixa de trabalho e linearidade • O desvio padrão residual (Sy), descreve o espalhamento (dispersão) dos valores informados sobre a linha de regressão calculada. É figura de mérito, descrevendo a precisão da calibração.
s y=
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
⎞2 ⎛ ∑ ⎜⎝ y i − yˆ i ⎟⎠
N −2
31
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA Faixa de trabalho e linearidade •
O desvio padrão do método (Sx0) é definido pela Norma como a razão entre o desvio padrão residual (Sy) e a sensitividade do método, podendo ser entendido como a “potência” do procedimento. A qualidade do procedimento analítico, analisada sob o ponto de vista da eficiência do método, aumenta com o aumento da sensitividade e com a diminuição do desvio padrão residual. O desvio padrão do método é uma característica que permite avaliar essa qualidade. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
sy s xo = b
32
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA Faixa de trabalho e linearidade • O coeficiente de variação do método (Vx0) é definido como a razão entre o desvio padrão do método (Sx0) e a concentração que é o centro da faixa de trabalho.
Coeficiente de variação
s xo X100 = V xo x
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
33
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA Faixa de trabalho e linearidade • O teste mais fácil para verificar a linearidade é a representação gráfica dos dados de calibração calculados sobre a linha de regressão. – Qualquer não linearidade é evidente.
• Uma outra forma de verificação da linearidade – Calcular e plotar os valores dos resíduos – (Resíduo é a diferença entre o valor observado e o valor projetado pela reta de regressão, para cada valor de x) – A distribuição aleatória em torno da linha reta confirma a linearidade. Tendências sistemáticas indicam a não linearidade.
• Teste de hipótese para verificação da linearidade (DOQ-CGCRE 008, rev.2) • Segundo a ISO 8466-1 EQUAÇÂO MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
34
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA Faixa de trabalho e linearidade • Outras formas para a verificação da linearidade encontradas na literatura são: • inspeção visual da curva de calibração, • representação gráfica dos resíduos versus a concentração ou o seu log • representação gráfica das respostas relativas (resposta dividida pela concentração) no eixo y e as concentrações ou o seu log no eixo dos x. • O coeficiente de correlação é frequentemente usado para medir a linearidade da linha de calibração, embora possa não suficiente para isso. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
35
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA Faixa de trabalho e linearidade • Critério para a linearidade gráfica, sugerido em guia da ISO para metais ISO / TC 47 / SC 1/WG 1 N5 •
O coeficiente de linearidade L é a razão entre a diferença de absorvâncias da solução de calibração mais alta da faixa de trabalho (A1,0) e da solução que corresponde a 80% (A0,8) da faixa de trabalho pela diferença de absorvâncias da solução que corresponde a 20% da faixa de trabalho (A0,2) e da solução branco (Ab). Esta relação não pode ser menor que 0,7. ⎛⎜ ⎞⎟ − A A 1 , 0 0 , 8 ⎠ L=⎝ ⎛⎜ ⎞⎟ − A A b⎠ ⎝ 0,2 MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
36
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção Limites de detecção e de quantificação Área extremamente polêmica – Vários tipos de níveis e limites de detecção são propostos – Os níveis de detecção podem estar associados diferentes tipos de limites. – Normalmente, as definições para os limite de detecção estão relacionadas ao desvio padrão dos valores medidos na concentração zero do constituinte ou em concentração próxima ao zero. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
37
X
X
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção • Limite de detecção (LOD ou LD) e Limite de quantificação (LOQ ou LQ) Eurachem – LOD pode ser determinado, segundo a EURACHEM, pela análise de brancos sucessivos, desde que esses brancos não tenham desvios padrão zero, e calculado LOD = x + t.s como
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
38
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção • Eurachem – prevê também que no caso de brancos adicionados e analisados pelo método completo, – LD = t.s Nesse caso, não se soma a média dos brancos, ou seja, analisando-se o constituinte, com presença sabida do analito, LD equivale ao conceito de MDL / EPA. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
39
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção • Eurachem • Limite de quantificação (LOQ) é definido como o nível acima do qual resultados quantitativos podem ser obtidos, com um grau de confiança específico. • Usualmente, LOQ equivale à concentração de 5 a 10 vezes o desvio padrão do branco MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
40
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção • Na prática • A partir de replicatas de branco, executar de sete a dez medidas do analito • Estimar o LOD (como três desvios padrão) e o LOQ (como cinco, seis e dez desvios padrão) • Preparar replicatas de branco ou matriz adicionada na concentração estimada do LOQ e analisar o constituinte para confirmar a aceitabilidade (dispersão e exatidão aceitáveis) segundo critério pré-estabelecido.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
41
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção • A confiança na concentração aumenta a medida que o sinal do constituinte aumenta acima do LOD. – O valor de LOQ = 10σ é recomendado, correspondendo a uma confiança relativa de ± 30% no valor medido (10σ ± 3σ) com um nível de confiança de 95%.
• Confiança relativa (gráfico de Taylor) onde N = múltiplos do desvio padrão. = 2 2 1 ×100 N
• LOQ é o limite mais útil para definir o ponto inferior da faixa útil da metodologia de medição. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
42
Confiança relativa
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 0 -20 -30 -40 -50 -60 -70
IR ( 95 %) = 2
3
5
10
15
20
25
2
1 × 100 N
30
35
40
Núm ero de desvios padrão (N)
-80 -90 -100
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
43
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção Outro procedimento prático para a determinação do LOD e LOQ, é proposto pelo documento ISO Draft Guideline GFAAS – são analisadas 12 (doze) replicatas – em cerca de cinco concentrações que devem variar em concentração de 0,5 a 5 vezes o limite esperado. – LOD é definido como a concentração, estabelecida graficamente, para a qual o desvio padrão relativo (RSD) das replicatas for em torno de 30% e o LOQ para a concentração na qual o RSD for cerca de 10%. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
44
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção Determinação do MDL (segundo EPA) – Faça uma estimativa do limite de detecção usando um dos procedimentos seguintes: – valor da concentração que corresponde a 2,5 a 5 vezes um sinal/ruído do instrumento; – três vezes o desvio padrão de medidas instrumentais de replicatas do branco; – a área da curva padrão onde existe uma mudança significativa na sensitividade, isto é, uma quebra (break) na inclinação (slope) da curva padrão; – limitações instrumentais; – experiência do analista. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
45
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção Determinação do MDL segundo EPA- continuação Se o MDL for determinado no branco (reagent blank water), prepare um padrão de laboratório (constituinte no branco) (recomenda-se entre 1 a 5 vezes o limite de detecção estimado do método). – Se o MDL for determinado em outra matriz de amostra, analise a amostra. – Se o nível medido = 1 a 5 vezes o limite de detecção estimado, utilize diretamente a matriz. – Se o nível < do que o limite de detecção estimado, adicione uma quantidade conhecida do constituinte para trazer o nível do constituinte entre 1 e 5 vezes o limite de detecção estimado. – Se o nível medido > do que 5 vezes o limite de detecção estimado, existem duas opções: - obter uma outra amostra de nível baixo do constituinte na mesma matriz se possível; - a amostra, como é, pode ser usada para determinar o limite de detecção do método, mas a significância decresce à medida que o nível do constituinte cresce a partir do MDL. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
46
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção Determinação do MDL segundo EPAcontinuação Procedimento – Tomar um mínimo de sete alíquotas da amostra a ser usada para calcular o limite de detecção do método e processá-las através de todo o método analítico. – Calcule o desvio padrão (s) das medidas e o MDL – MDL= t(n-1, 1-α=0.99).s MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
47
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção Determinação do MDL segundo EPA- continuação
Calcule o intervalo de confiança para a estimativa do MDL –
Os limites de confiança para o MDL estão computados nas equações a seguir: UCLMDL LICMDL 〉 MDL〉 P.025 P.975
– –
LCLMDL=0,64 MDL e UCLMDL=2,20MDL para uma confiança de 95% e na análise de sete alíquotas (df=6): MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
48
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção Determinação do MDL segundo EPA- continuação
– Um procedimento adicional é apresentado para testar a razoabilidade da estimativa do MDL e as determinações subsequentes do MDL na mesma matriz é feito por iterações –
MDL inicialmente calculado é testado adicionandose esta concentração à matriz e analisando as sete alíquotas.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
49
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção –
–
A cada iteração do cálculo do MDL, a variância do cálculo do MDL corrente e a variância do MDL precedente são comparadas pela computação da razão F(teste F) Então o desvio padrão pooled é calculado, e o MDL e o intervalo de confiança são calculados pelas seguintes equações: MDL=2,681.Spooled 2 2 Spooled =
2,681=t (12,1-α=99) LCLMDL = 0,72 MDL e
(S
A+
SB)
2
UCLMDL = 1,65 MDL
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
50
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção Determinação do MDL segundo EPAcontinuação
Exemplo MDL fenol
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
51
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – níveis de detecção • Outros métodos para estimar os limites de detecção – baseados no intervalo de confiança para o extremo inferior da curva de calibração – por extrapolação, onde o valor do desvio padrão do branco é inferido por uma curva traçada com a concentração no eixo dos x e o desvio padrão no eixo dos y.
• Estimado o LOD, estimar o LOQ e confirmar pela análise da concentração encontrada. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
52
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – sensibilidade • Sensibilidade é um parâmetro que descreve o quanto a resposta se modifica quando a concentração do analito varia. • Pode ser expressa pela inclinação da curva de regressão linear de calibração.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
53
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – dispersão Aspectos conceituais • O termo “precisão” não está mais no VIM. • O conceito de “precisão” está sempre ligado à dispersão dos resultados. • Se refere a proximidade dos resultados obtidos, entre si, num sistema de medição. • Está associada à presença de efeitos aleatórios e que estarão sempre presentes, sem poder serem eliminados. • Pode ser diferente em diferentes níveis de concentração, tendendo a ser maior em concentrações menores ou extremas. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
54
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – dispersão • Dependendo das condições analíticas em que é avaliada, os estimadores de dispersão podem assumir diferentes proporções • Sempre que as condições de medição são mais homogêneas, a dispersão tende a ser menor. • Em condições mais variadas ou heterogêneas, a precisão tende a ser maior.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
55
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – dispersão • São chamadas “condições de repetibilidade” quando os resultados independentes são obtidos usando o mesmo método, mesmo operador, mesmo equipamento, num curto intervalo de tempo. • As condições de reprodutibilidade ocorrem quando os resultados são obtidos usando o mesmo método, mas por diferentes laboratórios, diferentes equipamentos, diferentes operadores, num período de tempo maior. • Pode haver também uma condição chamada “reprodutibilidade intermediária” em que a reprodutibilidade é avaliada parcialmente, por um mesmo laboratório, mas com a variação de um ou mais dos fatores acima. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
56
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – dispersão • Repetibilidade : é a diferença máxima entre dois resultados individuais obtidos em condições de repetitividade. • Valor (ou limite) de repetitividade “r” é o valor abaixo do qual a diferença absoluta entre dois resultados de ensaio obtidos sob condição de repetitividade pode ser esperado com uma determinada probabilidade. • Limite (ou Valor) de repetitividade r = t∞ x √2 x sr
onde: t∞ (95%)=1,96 e sr é o desvio padrão medido sob condição de repetitividade. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
57
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – dispersão • Reprodutibilidade é a diferença máxima entre dois resultados individuais obtidos em condições de reprodutibilidade. • Valor de reprodutibidade “R” é o valor abaixo do qual a diferença absoluta entre dois resultados de ensaio obtidos sob condições de reprodutibilidade pode ser esperado com uma determinada probabilidade é dado pela fórmula: • Limite ( ou Valor ) de reprobutibilidade R = t∞ x √2 x σR – onde: t∞ (95%)=1,96 e σR é o desvio padrão medido sob condição de reprodutibilidade. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
58
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – dispersão • Medidas da dispersão – Sempre a variância, o desvio padrão ou a amplitude. Coeficiente de variação. – Desvio padrão - Coeficiente de variação 2 ∑ ( xi − x ) s CV = ×100 S= x n −1
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
59
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA – dispersão • Amplitude • R= xmax-xmin • Desvio padrão calculado a partir da amplitude: O desvio padrão é relacionado à amplitude, R, de várias série de medidas, amplitude média ( R ) das (k) séries de medidas, corrigindo pelo fator d*2, tabelado, o qual depende do número k de séries e do número de medidas em cada série. s = R d *2 MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
60
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - dispersão • Desvio padrão de duplicatas: o desvio padrão pode ser estimado a partir das diferenças de várias séries de duplicatas da mesma (ou similar) amostra. 2
∑d s= 2k
• Desvio padrão relativo de duplicatas (P. Bruce) para avaliar a precisão de amostras escolhidas na rotina ou selecionando-se de três a dez amostras do mesmo lote e analisando-as
sr = onde dri = (di/xi)*100
∑ d 2ri 2k
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
61
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - dispersão • •
•
Precisão intermediária (ISO 5725-3 e 5725-6) Pela carta de controle de amplitudes ou de desvio padrão, se a mesma estiver sendo utilizada no laboratório. (ISO 5725-6) ou o desvio ponderado apresentando as condições de modificação (ISO 5725-3). Onde, Onde t=número de séries (não é Student) e n=número de amostras em cada série.
1 2 Si( )= ∑ ( yi1− yi2) 2t
1 1n 2 Si( )= ∑ ∑ (yjk − yi ) t (n −1) j k
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
62
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - dispersão • Análise de variância: muito aplicada para tratar resultados de planejamento de experimentos realizados para a obtenção e possibilita a separação das variâncias e dos desvios padrão de repetitividade e de reprodutibilidade. • Facilitação BRUCE - precisão intra e inter-ensaio. Cálculo direto. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
63
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - dispersão • sr desvio padrão intra corridas; precisão p s2 intra-ensaios s2 = ∑ i r
i =1
p
p=número de dias ou ensaios si= desvio padrão do resultado de um dia
• sr + sL = desvio padrão inter corridas ou precisão inter-ensaios s2 +s2 = r L
[
2 2 2 ⎡ ⎤ p p ∑i =1 X − ⎢∑i =1 X ⎥ s i ⎣ i ⎦ − r ]+ s 2 r p( p −1) n MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
64
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - dispersão • Guia ABNT ISO Guia 33:2002
∑ (xi − x ) n
2
sw = i =1
– Precisão pelo uso de MRC, comparando-se o desvio padrão obtido com o requerido σ wo
χ
χ
2 = calc
2 = tab
χ MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
n −1
⎛ sw ⎞ ⎜ ⎟ ⎝ σ wo ⎠
χ
2 < calc
2
2 ( n −1);0,95
n −1
χ
2 tab 65
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - dispersão • Modelos teóricos • EQUAÇÃO DE HORWITZ e suas atualizações
( 1−0,5 log C ) CV = 2 • C=concentração do analito em quantidade de massa, por exemplo, C=1 para uma concentração de analito de 100% = 6
10
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
66
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA - dispersão • Avaliação: – Segundo o Eurachem, a repetitividade pode ser determinada quantitativamente por meio da análise repetida de padrões, material de referência ou adição a branco em várias concentrações na faixa de trabalho. Esta ainda pode ser avaliada para amostras. Sugere-se 7 ou mais repetições em cada situação – Para avaliar a repetitividade e a reprodutibilidade, pode ser apropriado a adoção de um planejamento experimental, com os resultados tratados por análise de variância ou suas simplificações para obtenção dos diferentes desvios padrão. – A Norma ISO 5725 apresenta várias complementações para esse tema: muito importante MODELO EXPERIMENTAL.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
67
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA- exatidão • O conceito de exatidão está ligado à diferença entre o valor medido e o valor real presente na amostra • Para sua avaliação – análise de material de referência preferencialmente certificado, valor do constituinte e sua incerteza são conhecidos, – padrões analíticos puros ou adicionados à matriz. – comparação com um método de referência. – Na avaliação da exatidão, procura-se verificar a presença de efeitos sistemáticos, bias ou tendência. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
68
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA- exatidão • Quantificação – Diferença absoluta ou percentual – Z score, sendo s a incerteza do MRC ou um valor estimado de variabilidade, especificado para atingir requisitos. – Erro normalizado, onde ulab é a incerteza do valor medido e ucert a incerteza do valor certificado.
Er =
xlab − Xcert x100 Xcert
z=
xlab− Xcert s
En =
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
xlab− Xcert ulab2 + ucert 2 69
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA- exatidão • Quantificação – Segundo o ABNT ISO GUIA 33:2002
σ D ≤ x − µ ≤ a1 + 2σ D
− a2 − 2
σ •
•
2 = D
σ
s
2 w
2 + Lm n
onde σD é o desvio padrão total associado ao processo de medição, e é composto por Sw, flutuação de curto prazo dentro do laboratório e σLm é o desvio mpadrão interlaboratório, podendo ser substituído pelo desvio padrão do MRC, or um desvio padrão de precisão intermediária ou por valores normalizados. Sw é usualmente muito pequeno quando comparado com σLm . Quando n≥10, pode-se simplificar a eq (1) , pois σLm equivale a σD.
σ Lm ≤ x − µ ≤ a1 + 2σ Lm
− a2 − 2
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
70
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA- exatidão • Quantificação – Recuperação da adição padrão • Três faixas
R% =
fortificado − nãofortificao CF medido CU medido
x100
conc.adicionada CAteórico
– Recuperação percentual em relação ao valor nominal (desvio)
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
71
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA- exatidão • Diferença de médias comparada ao desvio de propagação xe − xc < se 2 + sc 2 • onde xe− xc é o valor absoluto da diferença entre a média experimental e a média certificada ; e • é se 2 + sc 2 o desvio padrão de propagação, obtido da soma das variâncias associadas à determinação experimental e ao valor certificado. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
72
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA-robustez • A robustez é usualmente determinada no desenvolvimento de um novo método, realizado pelo laboratório proponente do método, antes mesmo de estudos colaborativos para o mesmo. • É a habilidade do resultado de um método em permanecer inalterado por pequenas mudanças nos parâmetros operacionais e ambientais, como temperatura ambiente, pH, concentração da fase móvel, materiais de diferentes procedências, temperatura e volume de injeção, etc (CHASI, et al.). • Inclui a avaliação de parâmetros operacionais críticos para o método e das tolerâncias que podem ser estabelecidas para esses de forma que os resultados possam sair dentro de limites de controle. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
73
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA-robustez • As variações são deliberadamente introduzidas sobre o método e investigam-se os efeitos subseqüentes no desempenho do método. Depois, é possível identificar as variáveis no método que têm os efeitos mais significativos, e assegurar que, ao usar o método, essas são controláveis. • Pode ser avaliada pela variação de um fator de cada vez e depois pela classificação desses fatores em ordem de importância para a alteração dos resultados, ou por um modelo de projeto de experimentos que englobe vários fatores ou níveis de fatores. As tolerâncias podem ser analisadas para níveis máximos e mínimos. • O Modelo de Youden (novel) é muito recomendado. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
74
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA-incerteza • Todas as componentes avaliadas • “balanço completo de incertezas” • Estimação – Eurachem Guide - Quam 2000 – ISO GUM
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
75
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA- uso e manutenção de métodos validados • A validação de um método da uma idéia da capacidade de desempenho de um método e das limitações que podem ser esperadas pelo seu uso rotineiro. • No uso rotineiro, controles específicos são necessários para verificar se o mesmo permanece desempenhando da maneira esperada. • Quando houver modificações, é necessário revalidar e somente depois, controlar. MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
76
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA- uso e manutenção de métodos validados • Programa de controle da qualidade interno: brancos, padrões de calibração, amostras adicionadas, amostras cegas, repetições, amostras-controle, avaliação periódica de MRC, entre outros. • Programa de controle da qualidade nterlaboratorial • O nível de controle é responsabilidade de cada laboratório, baseado na avaliação do risco, na confiabilidade do método, na possibilidade de repetição da análise, etc. • Exemplos de ferramentas de controle – – – –
Carta de controle tipo médias e amplitudes Carta de controle para recuperação Carta de controle para brancos Carta de controle de soma cumulativa para MRC MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
77
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA-
documentação de métodos validados •
•
• •
Uma vez cumpridas todas as etapas do processo de validação, é importante documentar os procedimentos de forma que o método possa ser implementado de maneira clara e sem ambigüidades. O processo de validação presume que o método vá ser usado sempre da mesma maneira, por isso tudo deve ser documentado para permitir verificar depois se alguma modificação não foi acidentalmente introduzida. A documentação apropriada auxilia na aplicação consistente do método. Isto porque durante o processo de validação, assume-se que o método, quando implantado, será sempre executado conforme descrito, caso contrário o desempenho real do método não irá corresponder ao desempenho previsto nos dados de validação. Logo, a documentação deve limitar a introdução de variação acidental no método. Documentações que registrem estas etapas serão necessárias também para fins de avaliação/auditoria ou podem ser exigidas por razões contratuais ou até mesmo regulatórias.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
78
VALIDAÇÃO EM ANÁLISE QUÍMICA-
documentação de métodos validados •
• • • • •
A qualidade da documentação de um método tem efeito direto na consistência de sua aplicação, já que influencia sua reprodutibilidade e a incerteza a este associada. Uma incerteza associada com métodos inadequadamente documentados pode ser tão grande que pode fazer o método inútil. Informações devem aparecer na ordem em que o usuário espera precisar dela Não assumir, sem os devidos cuidados, que os dados são inteligíveis por outra pessoa, a não ser por aquela que desenvolveu o processo de validação. Assegurar registro dos algorítimos de cálculo, planilhas, tabelas consultadas, entre outros. A aplicação de normas (como ISO 78) para o lay-out dos métodos pode ser útil Controle da documentação do sistema da qualidade: formato padrão, autorização, distribuição, atualização.
MINI-CURSO VALIDAÇÃO Margareth Westin D. Azevedo
79