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- Words: 809
- Pages: 7
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS
Métodos de análisis
Determinación de proteinas por el método de Lowry y Bradford
Elaboro: Chávez Vega Joel Daniel Grupo: 4IM1
Seccion: 3
Maestro:
Fecha de entrega: 18/02/19
Resultados. Lowry Tubo No. 1 2 3 4 5
𝑨𝟓𝟗𝟎
Cantidad de poteina (µg) 25 50 75 100 125
Serie a 0.081 0.109 0.147 0.185 0.208
Cantidad de poteina (µg) 25 50 75 100 125
Serie a 0.328 0.499 0.616 0.793 0.808
Serie b 0.059 0.109 0.152 0.204 0.235
Bradford Tubo No. 1 2 3 4 5
𝑨𝟓𝟗𝟓 Serie b 0.428 0.446 0.650 0.749 0.906
Tubo 1 𝑚𝑔 0.25 × 0.1 𝑚𝑙 = 0.025𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 0.025𝑚𝑔 = 25𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 𝑚𝑙 Tubo 2 0.25
𝑚𝑔 × 0.2 𝑚𝑙 = 0.050𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 0.050𝑚𝑔 = 50𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 𝑚𝑙
Curva de calibración de Albumina 0.9 y = 0.0050x + 0.2456 R = 0.9758
0.8
0.7
0.6
A (nm)
Método de Lowry 0.5
Método de Bradford Linear (Método de Lowry )
0.4
Linear (Método de Lowry ) Linear (Método de Bradford)
0.3
Linear (Método de Bradford) 0.2 y = 0.00155x + 0.03235 R = 0.9846
0.1
0 0
20
40
60
80
Concentración (µg)
100
120
140
•
Replicas para el análisis estadístico y resultados del análisis estadístico
lowry Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
𝐴590 0.124 0.161 0.164 0.070 0.140 0.272 0.144 0.166 0.195 0.129
Bradford 𝐴595
Cantidad de proteína (µg) 58.97 82.78 84.71 24.22 69.27 154.21 71.84 86.00 104.66 62.19
0.576 0.604 0.619 0.658 0.630 0.636 0.621 0.655 0.649 0.673
Cantidad de proteína (µg) 65.73 71.30 74.29 82.05 76.48 77.67 74.69 81.45 80.26 85.03
𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏 𝑏 = 0.03235
𝑏 = 0.2456
𝑚 = 1.554𝑥10−3
𝑚 = 5.026𝑥10−3
𝑟 = 0.9846
𝑟 = 0.9757 𝑥=
𝑥=
𝑦−𝑏 𝑚
𝐴590 −0.03235
𝑥=
1.554𝑥10−3
𝐴595 −0.2456 5.026𝑥10−3
Tubo 1
𝑥=
(0.124)−0.03235
𝑥=
1.554𝑥10−3
𝑥 = 58.97 𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎
(0.576)−0.2456 5.026𝑥10−3
𝑥 = 65.73 𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎
Tubo 2
𝑥=
(0.161)−0.03235
𝑥=
1.554𝑥10−3
𝑥 = 84.71 𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎
(0.604)−0.2456 5.026𝑥10−3
𝑥 = 71.30 𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎
Lowry
𝑿 79.885
S 33.7204
𝑺𝟐 1137.06
%C.V 42.21
Bradford
76.895
5.7077
32.5784
7.4227
µ 55.7645 104.0054 52.7745 – 101.0154
%Er 6.52 2.52
𝑋=
𝑋𝑖 𝑛
𝑋 = 79.885
𝑋 = 76.895 2
(𝑋𝑖 − 𝑋) 𝑠=√ 𝑛−1
𝑠 = 33.7204
𝑠 = 5.7077
𝑆 2 = 1137.06
𝑆 2 = 32.5784
%𝐶. 𝑉 =
%𝐶. 𝑉 =
33.7204 79.885
𝑆 𝑥 100 𝑋 5.7077
𝑥 100
%𝐶. 𝑉 = 76.895 𝑥 100
%𝐶. 𝑉 = 42.21
%𝐶. 𝑉 = 7.4227
𝜇=𝑋 ±
𝜇= 𝜇=
79.885
±
(33.7204 )(2.262) √10
(𝑆)(𝑡95 ) √𝑛
𝜇 = 76.895 ±
𝐷=
∑𝑛 𝑖=1
𝐷𝑖
𝑛
26.9 10
√10
𝜇 = 52.7745 – 101.0154
55.7645 - 104.0054
Pruebas de exactitud y precisión 𝐷=
(5.7077)(2.262)
= 2.96
SD=26.81 tcal=0.3491 𝐹𝐶𝐴𝐿 =
𝑆𝐵2 1137.06 = = 34.9022 𝑆𝐴2 32.5784
● Tubo No.
6 7 8 9 10
Efecto de algunas sustancias no proteicas que interfieren en los metodos
Lowry Sustancia
𝐴590
Cantidad de proteina(µg)
Fenol 1% Mercaptoetanol Tris 1M Urea (NH4)2S04
1.728 0.272 0.200 0.336 0.232
1091.15 142.21 107.88 195.39 128.47
Interferencia
Bradford Cantidad de 𝐴595 proteina (µg)
Interferencia
Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva
0.634 0.779 0.676 0.823 0.562
Positiva Positiva Positiva Positiva positiva
121.25 150.10 129.61 158.86 106.93
Discusiones. 𝝀 Numero de reacciones Color Tiempo de reaccion Tiempo estable Temperatura Materia Costo
Lowry 590 2 Azul claro 40 min 120 min Alto
Bradford 595 1 Azul fuerte 10 min 40 - 60 min Temperatura ambiente Tiñe el plastico Bajo
El procedimiento de Lowry está sujeto a la interferencia por compuestos como el ion potasio, magnesio, EDTA, Tris, reactivos con grupos tiol y carbohidratos. Requiere de más tiempo que otros ensayos. En el método de lowry el fenol como el Mercaptoetanol presentaron una interferencia positiva esto se debe a que el grupo r de la tirosina es igual al fenol, y el Mercaptoetanol tiene un grupo tiol. La desventaja es que depende de las concentraciones de ciertos aminoácidos presentes como la tirosina y el triptófano lo contrario al método de Bradford. En el metodo de Bradford los tubos 1 y 2 tenían espuma los cuales contenían detergente y el SDS el cual está presente en detergentes, ambos presentaron concentraciones bajas e incluso negativas esto se debe a que los detergentes las van a precipitar.
Conclusiones. ●
El método de Bradford es mucho más sensible que el método de Lowry.
● El coeficiente de variación es la precisión del analista la cual es de un valor máximo de 4.55% ● El método de Lowry y Bradford métodos útiles para la determinación de proteínas
Referencias.
● ● ● ●
http://www.iib.unsam.edu.ar/archivos/docencia/licenciatura/biotecnologia/2017/Qui micaBiol/1489768358.pdf http://www3.uah.es/bioquimica/Sancho/farmacia/practicas/Lowry.pdf http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/jaislocr/BIOQUIMICA_I/PRACTICA_6.pdf Lowry, O. H.; N. J. Rosebrough; A. L. Farr and R. J. Randall. 1951. “Protein Measurement with the Follin-Phenol Reagent”. J. Biol. Chem. 193:265-257
Métodos de análisis
Determinación de proteinas por el método de Lowry y Bradford
Elaboro: Chávez Vega Joel Daniel Grupo: 4IM1
Seccion: 3
Maestro:
Fecha de entrega: 18/02/19
Resultados. Lowry Tubo No. 1 2 3 4 5
𝑨𝟓𝟗𝟎
Cantidad de poteina (µg) 25 50 75 100 125
Serie a 0.081 0.109 0.147 0.185 0.208
Cantidad de poteina (µg) 25 50 75 100 125
Serie a 0.328 0.499 0.616 0.793 0.808
Serie b 0.059 0.109 0.152 0.204 0.235
Bradford Tubo No. 1 2 3 4 5
𝑨𝟓𝟗𝟓 Serie b 0.428 0.446 0.650 0.749 0.906
Tubo 1 𝑚𝑔 0.25 × 0.1 𝑚𝑙 = 0.025𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 0.025𝑚𝑔 = 25𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 𝑚𝑙 Tubo 2 0.25
𝑚𝑔 × 0.2 𝑚𝑙 = 0.050𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 0.050𝑚𝑔 = 50𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 𝑚𝑙
Curva de calibración de Albumina 0.9 y = 0.0050x + 0.2456 R = 0.9758
0.8
0.7
0.6
A (nm)
Método de Lowry 0.5
Método de Bradford Linear (Método de Lowry )
0.4
Linear (Método de Lowry ) Linear (Método de Bradford)
0.3
Linear (Método de Bradford) 0.2 y = 0.00155x + 0.03235 R = 0.9846
0.1
0 0
20
40
60
80
Concentración (µg)
100
120
140
•
Replicas para el análisis estadístico y resultados del análisis estadístico
lowry Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
𝐴590 0.124 0.161 0.164 0.070 0.140 0.272 0.144 0.166 0.195 0.129
Bradford 𝐴595
Cantidad de proteína (µg) 58.97 82.78 84.71 24.22 69.27 154.21 71.84 86.00 104.66 62.19
0.576 0.604 0.619 0.658 0.630 0.636 0.621 0.655 0.649 0.673
Cantidad de proteína (µg) 65.73 71.30 74.29 82.05 76.48 77.67 74.69 81.45 80.26 85.03
𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏 𝑏 = 0.03235
𝑏 = 0.2456
𝑚 = 1.554𝑥10−3
𝑚 = 5.026𝑥10−3
𝑟 = 0.9846
𝑟 = 0.9757 𝑥=
𝑥=
𝑦−𝑏 𝑚
𝐴590 −0.03235
𝑥=
1.554𝑥10−3
𝐴595 −0.2456 5.026𝑥10−3
Tubo 1
𝑥=
(0.124)−0.03235
𝑥=
1.554𝑥10−3
𝑥 = 58.97 𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎
(0.576)−0.2456 5.026𝑥10−3
𝑥 = 65.73 𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎
Tubo 2
𝑥=
(0.161)−0.03235
𝑥=
1.554𝑥10−3
𝑥 = 84.71 𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎
(0.604)−0.2456 5.026𝑥10−3
𝑥 = 71.30 𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎
Lowry
𝑿 79.885
S 33.7204
𝑺𝟐 1137.06
%C.V 42.21
Bradford
76.895
5.7077
32.5784
7.4227
µ 55.7645 104.0054 52.7745 – 101.0154
%Er 6.52 2.52
𝑋=
𝑋𝑖 𝑛
𝑋 = 79.885
𝑋 = 76.895 2
(𝑋𝑖 − 𝑋) 𝑠=√ 𝑛−1
𝑠 = 33.7204
𝑠 = 5.7077
𝑆 2 = 1137.06
𝑆 2 = 32.5784
%𝐶. 𝑉 =
%𝐶. 𝑉 =
33.7204 79.885
𝑆 𝑥 100 𝑋 5.7077
𝑥 100
%𝐶. 𝑉 = 76.895 𝑥 100
%𝐶. 𝑉 = 42.21
%𝐶. 𝑉 = 7.4227
𝜇=𝑋 ±
𝜇= 𝜇=
79.885
±
(33.7204 )(2.262) √10
(𝑆)(𝑡95 ) √𝑛
𝜇 = 76.895 ±
𝐷=
∑𝑛 𝑖=1
𝐷𝑖
𝑛
26.9 10
√10
𝜇 = 52.7745 – 101.0154
55.7645 - 104.0054
Pruebas de exactitud y precisión 𝐷=
(5.7077)(2.262)
= 2.96
SD=26.81 tcal=0.3491 𝐹𝐶𝐴𝐿 =
𝑆𝐵2 1137.06 = = 34.9022 𝑆𝐴2 32.5784
● Tubo No.
6 7 8 9 10
Efecto de algunas sustancias no proteicas que interfieren en los metodos
Lowry Sustancia
𝐴590
Cantidad de proteina(µg)
Fenol 1% Mercaptoetanol Tris 1M Urea (NH4)2S04
1.728 0.272 0.200 0.336 0.232
1091.15 142.21 107.88 195.39 128.47
Interferencia
Bradford Cantidad de 𝐴595 proteina (µg)
Interferencia
Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva
0.634 0.779 0.676 0.823 0.562
Positiva Positiva Positiva Positiva positiva
121.25 150.10 129.61 158.86 106.93
Discusiones. 𝝀 Numero de reacciones Color Tiempo de reaccion Tiempo estable Temperatura Materia Costo
Lowry 590 2 Azul claro 40 min 120 min Alto
Bradford 595 1 Azul fuerte 10 min 40 - 60 min Temperatura ambiente Tiñe el plastico Bajo
El procedimiento de Lowry está sujeto a la interferencia por compuestos como el ion potasio, magnesio, EDTA, Tris, reactivos con grupos tiol y carbohidratos. Requiere de más tiempo que otros ensayos. En el método de lowry el fenol como el Mercaptoetanol presentaron una interferencia positiva esto se debe a que el grupo r de la tirosina es igual al fenol, y el Mercaptoetanol tiene un grupo tiol. La desventaja es que depende de las concentraciones de ciertos aminoácidos presentes como la tirosina y el triptófano lo contrario al método de Bradford. En el metodo de Bradford los tubos 1 y 2 tenían espuma los cuales contenían detergente y el SDS el cual está presente en detergentes, ambos presentaron concentraciones bajas e incluso negativas esto se debe a que los detergentes las van a precipitar.
Conclusiones. ●
El método de Bradford es mucho más sensible que el método de Lowry.
● El coeficiente de variación es la precisión del analista la cual es de un valor máximo de 4.55% ● El método de Lowry y Bradford métodos útiles para la determinación de proteínas
Referencias.
● ● ● ●
http://www.iib.unsam.edu.ar/archivos/docencia/licenciatura/biotecnologia/2017/Qui micaBiol/1489768358.pdf http://www3.uah.es/bioquimica/Sancho/farmacia/practicas/Lowry.pdf http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/jaislocr/BIOQUIMICA_I/PRACTICA_6.pdf Lowry, O. H.; N. J. Rosebrough; A. L. Farr and R. J. Randall. 1951. “Protein Measurement with the Follin-Phenol Reagent”. J. Biol. Chem. 193:265-257
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