Aktivitas Nitrat Reduktase.docx

AKTIVITAS NITRAT REDUKTASE

Oleh: Sekar Tyas Pertiwi Eliningsih Riama Kustianingrum Heri Priyanto

Rombongan Kelompok Asisten

B1A016080 B1A016081 B1A016082 B1A016091

:I :1 : Rezti Arvina Widyaputri

LAPORAN PRAKTIKUM FISIOLOGI TUMBUHAN I

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2017

I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Enzim merupakan suatu protein yang disentesa oleh sel hidup yang berfungsi mengkatalisa jenis reaksi kimia tertentu yang terjadi di dalam dan di luar sel yang menghasilkannya. Berdasarkan hal itu maka enzim juga dapat dinamakan biokatalisator. Enzim akan meningkatkan dengan nyata kecepatan reaksi kimia spesifik, yang apabila tanpa enzim akan berlangsung sangat lambat. Enzim tidak dapat mengubah titik keseimbangan reaksi dikatalis olehnya. Enzim juga tidak akan habis dipakai atau diubah secara permanent oleh reaksi tersebut. Enzim meningkatkan kecepatan reaksi kimia dengan menurunkan energi aktivasi. Energi aktivasi adalah jumlah energi yang diperlukan untuk membawa semua molekul senyawa pada kondisi lingkungan tertentu menuju tingkat trasnsisi pada puncak batas energi (Lehninger, 1993). Nitrat reduktase merupakan salah satu enzim tanaman yang sangat intensif diteliti. Perhatian besar terhadap regulasi nitrat reduktase tersebut terutama karena aktivitas enzim tersebut merupakan faktor pembatas proses asimilasi nitrat yang berperan penting terhadap pertumbuhan dan produktivitas tanaman (Alnopri et al., 2004). Menurut Parman (2007), aktivitas nitrat reduktase sangat mempengaruhi pertumbuhan

tubuh

tumbuhan

karena

protein

berperan

penting

dalam

pembentukan maupun penggantian sel tumbuhan. Pengukuran aktivitas enzim merupakan salah satu upaya untuk mengetahui tingkat metabolisme tumbuhan. Diantanya adalah enzim nitrat reduktase karena nitrat reduktase merupakan enzim yang penting dalam rantai reduksi unsur nitrat menjadi amonia yang berguna dalam pembentukan asam amino, protein, klorofil dan senyawa-senyawa lain yang mengandung unsur nitrogen. Senyawa-senyawa tersebut sangat penting dalam proses pertumbuhan vegetatif dan generatif suatu tanaman (Lea & Leegood, 1993). B. Tujuan Tujuan acara praktikum aktivitas nitrat reduktase kali ini adalah untuk mengetahui aktivitas nitrat reduktase pada tanaman.

II. TELAAH PUSTAKA Metabolisme merupakan salah satu aspek paling penting bagi kehidupan tanaman dan juga hewan. Metabolisme nitrogen dapat didefinisikan sebagai serangkaian dari proses biokimia yang mengambil tempat di dalam atau di luar tubuh tanaman berupa pembentukan kompleks nitrogen dari molekul-molekul sederhana dan

perombakan

kompleks

nitrogen

menjadi

molekul-molekul

sederhana

pembentuknya. Berdasarkan pengertian ini metabolisme nitrogen termasuk di dalamnya anabolisme, yaitu proses pembentukan dan katabolisme yaitu proses perombakan. Proses anabolisme penting termasuk di dalamnya ialah fiksasi nitrogen, sintesis asam amino dan sintesis protein. Katabolisme termasuk didalamnya proteolisis, perombakan asam amino, denitrifikasi dan nitrifikasi. Proses anabolisme dan katabolisme nitrogen terjadi di alam untuk mensuplai nitrogen tanaman dan nitrogen makhluk hidup lain. Nitrogen di atmosfer terjaga hampir selalu konstan yaitu 75-80%. Serangkaian reaksi metabolisme nitrogen dari atmosfer dan kembali lagi ke atmosfer dinamakan siklus nitrogen. Siklus utama nitrogen meliputi fiksasi, ammonifikasi, nitrifikasi dan dentrifikasi (Padney & Sinha, 1990). Nitrat reduktase (NR) merupakan enzim yang mengkatalis nitrat menjadi nitrit dan bersifat inducible karena aktivitasnya dapat ditingkatkan dengan perubahan substrat. Tumbuhan memperoleh nitrogen dengan cara menyerap nitrat atau ion amonia yang ada dalam tanah, penyerapan kedua senyawa ion tersebut digunakan untuk membentuk berbagai senyawa nitrogen, misalnya protein. Aktivitas nitrat reduktase dapat ditentukan dengan mengukur absorbansinya, yaitu dengan menggunakan spektrofotometri. Sampel yang akan diukur direndam dalam buffer Na-fosfat selama 24 jam, kemudian larutan buffer diganti dengan yang baru dan ditambah dengan NaNO3 dengan molaritas yang berbeda kemudian diinkubasi selama 3 jam pada botol film gelap. Aktivitas enzim nitrat reduktase pada daun tanaman dewasa berhubungan dengan hasil tanaman, sehingga tingkat aktivitas enzim nitrat reduktase dapat digunakan sebagai kriteria seleksi untuk memilih genotip dari suatu tanaman yang berdaya hasil tinggi. Enzim nitrat reduktase berguna untuk merubah nitrat menjadi nitrit yang kemudian setelah melalui serangkaian kerja enzim lain nitrit ini akan diubah menjadi asam amino (Salisbury & Ross, 1995). Alnopri et al. (2004) menambahkan bahwa ANR banyak digunakan sebagai kriteria seleksi tanaman pada program pemuliaan tanaman. Pendekatan berdasarkan

ANR sebagai kriteria seleksi dapat dipertimbangkan, karena enzim yang dikendalikan oleh gen yang secara langsung terlibat dalam proses biosintesis protein. NR merupakan enzim pertama yang berperan dalam mereduksi nitrat menjadi amonia. Reaksi pembentukan NO2- berlangsung dengan pereduksian nitrat menjadi nitrit dikatalis dengan enzim nitrat reduktase (NR). Cara kerja enzim ini dengan mengikat 2 elektron dari NADH atau NADPH2 menghasilkan nitrit, NAD- dan H2O menurut reaksi: NO3- + NADH + H

NR

NO2- + NAD+ + H2O

Mekanisme kerja NR yaitu nitrat reduktase akan mereduksi NO3- menjadi NO2-, selanjutnya oleh nitrit reduktase akan direduksi menjadi ammonium (NH 4+). Amonia merupakan senyawa nitrogen utama yang dibebaskan dalam pembusukan asam organik. Amonia dalam tanah langsung dioksidasi menjadi nitrat oleh bakteri sehingga ion nitrat biasanya merupakan sumber nitrogen bagi tumbuhan. Ion nitrat setelah diserap harus direduksi kembali menjadi amonia (Lea & Leegood, 1993). Menurut Salisbury dan Ross (1995), reaksi nitrat terjadi dalam dua tahap reaksi yang dikatalis oleh nitrat reduktase. Enzim NR yang mengangkut dua elektron dan NADPH, pada beberapa NADPH, hasilnya berupa nitrit, NAD+ (NADP+) dan H2O. Reaksi kedua yaitu perubahan nitrat menjadi amonia (NH4) yang dikatalis oleh nitrit reduktase (NiR).

III.

MATERI DAN METODE

A. Materi

Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah tabung gelap, tabung reaksi, timbngan analitik, spektrofotometer, cutter, gelas ukur dan mikropipet. Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah sampel daun kacang (Arachis hypogaea), akuades, larutan NaNO3 5 M, larutan buffer fosfat 0,1 M (Na2HPO4 dan NaH2PO4), N-naftil etilin diamine (NED) 0,02%, larutan sufanil amide (SE) 1% dalam HCl 3 N. B. Metode

Pengukuran ANR Cara kerja dalam praktikum kali ini: 1. Daun ketiga dari pucuk tanaman diambil, dicuci dan diiris (tulang daun dibuang) kemudian ditimbang seberat 200 mg. 2. Irisan daun yang telah ditimbang dimasukkan ke dalam larutan buffer fosfat 0,1 M dengan pH 7,5 dan volume 5 mL, selama 24 jam dalam tabung gelap. 3. Setelah 24 jam, larutan buffer diganti dengan larutan buffer baru dengan volume yang sama dan diberi 0,1 mL NaNO3 5 M sebagai substrat, selanjutnya diinkubasi selama 3 jam di tabung gelap. 4. Sementara itu, 0,2 mL larutan sulfanil amide dan 0,2 mL larutan N-naftil etilen diamine dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang lain sebagai reagen warna. 5. Setelah diinkubasi 3 jam, 0,1 mL aliquot diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi reagen warna. 6. Campuran ditunggu hingga ada perubahan warna larutan menjadi warna merah muda. 7. Kemudian pada tabung reaksi ditambah 2,5 mL aquades sebagai pengencer warna, sehingga volume larutan menjadi 3 mL. 8. Absorbansi larutan tersebut diukur dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. 9. Dari spektrofotometer akan diperoleh nilai absorbansi untuk selanjutnya nilai ANR daun ditetapkan dengan menggunakan kurva standr nitrit.

Pembuatan Kurva Standar NO2 1. Larutan induk NaNO2 dibuat dengan menimbang 1,5 gram NaNO2 kemudian dilarutkan dalam akuades hingga volume 1 L. Konsentrasi 1000 ppm NO2. 2. Larutan stok NaNO2 dibuat dengan mengambil 10 mL larutan induk dan kemudian ditambah dengan akuades hingga volume 100 mL. Rumus pengenceran: V1 X M1 = V2 X M2 M2 = V1 X M1 V2 M2 = 10 X 1000 100 = 100 ppm 3. Larutan NaNO2 dengan konsentrasi 0 ppm, 4 ppm, 8 ppm, 12 ppm, 16 ppm, 20 ppm, 24 ppm dan 28 ppm dibuat dengan ketentuan seperti pada tabel dibawah ini. Konsentrasi Larutan

Volume Larutan

Volume Akuades

NaNO2 (ppm)

NaNO2 (mL)

(mL)

0

0

10

4

0,4

9,6

8

0,8

9,2

12

1,2

8,8

16

1,6

8,4

20

2

8

24

2,4

7,6

28

2,8

7,4

4. Larutan NaNO2 tiap konsentrasi diambil 0,1 mL dan ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 0,2 mL larutan sulfanil amide dan 0,2 mL larutan N-naftil etilene diamine. 5. Selanjutnya, larutan ditambahkan akuades sebanyak 2,5 mL sehingga volume larutan menjadi 3 mL. 6. Absorbansi larutan NaNO2 diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. 7. Nilai absorbansi (Y) dan kandungan nitrit (X) diukur melalui 𝑥 =

𝑦−0.0854 0.0651

.

Cara Pembuatan Beberapa Larutan Pembuatan Buffer Fosfat untuk volume 100 mL 1. Larutan stok 0,2 M NaH2PO4 (A) dan 0,2 M Na2HPO4 (B) dibuat dengan menimbang 2,7598 gram NaH2PO4 dan 2,5598 gram Na2HPO4 kemudian masing-masing dilarutkan dengan akuades hingga volume 100 mL. 2. Kedua larutan stok dicampur dengan masing-masing volume sesuai dengan pH yang ditentukan yakni 7,5. Sehingga larutan stok A yang dibutuhkan adalah 16 mL dan larutan stok B sebanyak 84 mL. 3. Ukur pH dengan pH meter, apabila pH kurang 7,5 ditambahkan NaOH dan apabila pH lebih dari 7,5 ditambahkan HCl. A (mL)

B (mL)

pH

92,0

8,0

5,8

87,7

12,3

6,0

81,5

18,5

6,2

68,5

31,5

6,5

62,5

37,5

6,6

56,5

43,5

6,7

51,0

49,0

6,8

45,0

55,0

6,9

39,0

61,0

7,0

33,0

67,0

7,1

28,0

72,0

7,1

23,0

77,0

7,3

19,0

81,0

7,4

16,0

84,0

7,5

8,5

91,5

7,8

5,3

94,7

8,0

Pembuatan SA 1% SA ditimbang sebanyak 10 gram kemudian ditambahkan HCl 3 N hingga volume 1 L. Pembuatan NED 0,02% NED ditimbang sebanyak 0,2 gram kemudian ditambahkan akuades hingga volume 1 L.

Pembuatan NaNO3 5 M NaNO3 ditimbang sebanyak 424,95 gram kemudian ditambahkan akuades hingga volume 1 L.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Tabel 3.1 Hasil Pengukuran Absorbansi Rombongan I Bahan

I

II

III

IV

V

Kompos

2.7127

2.8049

3.1730

4.7550

4.6500

Urea

3.7419

2.5437

3.6800

1.6000

5.8800

KNO3

2.9739

2.9431

3.5110

0.9300

4.8800

Perhitungan Hasil Absorbansi Kelompok 1 Rombongan I 𝑲𝒐𝒎𝒑𝒐𝒔: 𝑥=

𝑦 − 0.0854 0.2620 − 0.0854 = = 2.7127 0.0651 0.0651

𝑼𝒓𝒆𝒂: 𝑥=

𝑦 − 0.0854 0.3290 − 0.0854 = = 3.7419 0.0651 0.0651

𝑲𝑵𝑶3: 𝑥=

𝑦 − 0.0854 0.2790 − 0.0854 = = 2.9739 0.0651 0.0651

Gambar 3.1 Larutan Daun beserta Sulfinil Amid dan N-Naftil Diamin

Gambar 3.2 Larutan Aliquot

Gambar 3.3 Larutan SA dan NED beserta Aliquot

B. Pembahasan Berdasarkan hasil praktikum yang didapat oleh Kelompok 1 Rombongan I, perlakuan urea memberikan hasil paling tinggi dalam aktivitas enzim nitrat reduktase, berturut-turut diikuti oleh KNO3 dan Kompos. Hal tersebut sesuai dengan pernyataan Ruskandi (1996) yang memberikan penjelasan mengenai kadar nitrogen dalam masing-masing media dan urea adalah media yang mengandung kadar nitrogen tertinggi dengan persentase 45-46%. Persentase tersebut adalah yang paling tinggi dibandingkan dengan dua media lainnya. Kandungan N yang tinggi pada Urea sangat dibutuhkan pada pertumbuhan awal tanaman. Menurut Gardener et al. (1991), aktivitas nitrat reduktase dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya: 1. Pengaruh pH Jika suatu enzim menunjukkan kegiatan pada pH tertentu, makan pH turun atau naik akan mempengaruhi aktivitas enzim tersebut, oleh karena itu pada pengukuran ANR digunakan buffer Na-fosfat untuk mengkonstankan atau menyeimbangkan pH-nya. Masing-masing enzim juga mempunya pH optimum yang berbeda-beda. 2. Pengaruh konsentrasi Konsentrasi berbanding lurus dengan kegiatan enzim, selain itu konsentrasi zat juga berpengaruh pada kerja enzim. 3. Temperatur Enzim tahan pada temperatur yang rendah 0˚C dan akan mati apabila temperatur diatas 50˚C. 4. Cahaya yang ditangkap oleh daun Cahaya akan meningkatkan ANR dan peningkatan lebih nyata laju reduksi nitrat menjadi ammonium (Salisbury & Ross, 1995). 5. Pengaruh zat penghambat Zat penghambat dapat berupa tannin dan fenol, yang merupakan hasil metabolit sekunder. Banyak ditemukan pada tanaman yang tua. 6. Umur tanaman Pada saat umur tanaman masih muda, ANR akan naik dn mencapai maksimal, selanjutnya akan menurun selama penuaan.

Tumbuhan tidak dapat menambat N2, sebagai sumber nitrogen utamanya adalah NO3 dan NH4. Kebanyakan dari tanaman menyerap nitogen dalam bentuk NO- sebab NH4+ segera dioksidasi menjadi NO3- oleh bakteri nitrifikasi. Nitrat adalah senyama dalam jumlah yang besar disebagian besar tanah dan nitrat harus diubah menjadi NH4 di dalam tumbuhan. Asimilasi nitrat merupakan perubahan nitrat menjadi amonium atau amonia tahapan pengubahan ini melibatkan beberapa enzim sebagai katalisatornya seperti nitrat reduktase, nitrit reduktase, hiponitrit reduktase, hidroksilamin reduktase dan hidroksilamin reduktase. Tahapan perubahannya dapat dikatakan sebagai proses reduksi nitrat, yaitu dengan urutan Nitrat – Nitrit – Hiponitrit – Hydroksilamin – Amonia. Asimilasi nitrat berlangsung di akar (Salisbury & Ross, 1995). Reaksi redoks nitrat adalah sebagai berikut: NO3 + 8e + 10H -------------------- NH4 + 3 H2O Reduksi nitrat terjadi dalam dua reaksi berbeda yang dikatalisis oleh nitrat reduktasi (NR) yakni enzim yang mengangkut 2 oksigen dari NADH atau dari NADPH. Hasilnya berupa nitrit (NO2), NAD atau NADP dan H2O. Dapat dituliskan dalam reaksi sebagai berikut: NR NO3 + NADH + H ------------------------ NO2 + NAD + H2O Reaksi ini terjadi di dalam sitosol di luar setiap organela. Aktivitas NR mempengaruhi laju sintesis protein dalam tumbuhan (Salisbury & Ross, 1995). Nitrogen (N) merupakan makronutrien penting yang ketersediaannya di tanah memiliki peran penting dalam pertumbuhan dan perkembangan tanaman, serta hasil panen. Nitrat (NO3) dan amonium (NH4+ ) adalah bentuk N yang banyak digunakan oleh tanaman. Nitrat (NO3− ) merupakan salah satu sumber N yang melimpah di alam sebagai sistem pertanian. Selain perannya sebagai nutrisi, NO3 juga bisa bertindak sebagai sinyal molekul yang memodulasi ekspresi gen dan berbagai macam proses termasuk pertumbuhan tanaman, rancangan sistem akar, perkembangan daun, dormansi biji dan waktu pembungaan (O’Brien et al., 2016). Menurut Poedjiadi (1994), larutan NaNO3 dengan ion nitrat (NO3) berfungsi sebagai subtrat yang akan dipecah oleh enzim nitrat reduktase menjadi nitrit (NO2). Daintith (2005) menjelaskan bahwa penambahan reagen sulfinil amida (SA) dan n-Etilendiamin (NED) pada larutan berfungsi untuk mengetahui

terjadinya proses reduksi nitrat yang ditandai dengan perubahan warna larutan menjadi merah muda. Perubahan warna menjadi merah muda menunjukkan bahwa nitrat tereduksi seluruhnya atau nitrat telah habis bereaksi. Urea merupakan pupuk buatan hasil persenyawaan NH4 (ammonia) dengan CO2. Bahan dasarnya biasanya berupa gas alam dan merupakan ikatan hasil tambang minyak bumi. Kandungan N total berkisar antara 45-46 %. Dalam proses pembuatan Urea sering terbentuk senyawa biuret yang merupakan racun bagi tanaman kalau terdapat dalam jumlah yang banyak. Agar tidak mengganggu kadar biuret dalam Urea harus kurang 1,5-2,0 %. Kandungan N yang tinggi pada Urea sangat dibutuhkan pada pertumbuhan awal tanaman (Ruskandi, 1996). Pupuk kompos mempunyai kandungan bahan organik yang mencapai 18 % bahkan ada yang mencapai 59 %. Unsur lain yang dikandung oleh kompos adalah nitrogen, fosfor, kalsium, kalium dan magnesium. Manfaat bokhasi pada lahan pertanian yaitu: mampu menggantikan dan mengefektifkan penggunaan pupuk kimia (anorganik) sehingga biaya pembelian pupuk dapat ditekan, bebas dari biji tanaman, tidak berbau dan mudah digunakan dan memperbaiki derajat keasaman tanah, selain itu sangat berguna untuk menyuburkan tanaman (Ruskandi, 1996). KNO3 (Potasium Nitrat) adalah pupuk yang dapat larut dalam air yang mengandung unsur Nitrogen sebanyak 13% dan Potasium (K2O) sebanyak 46% serta Cl sebanyak 2%. KNO3 berfungsi dalam pertumbuhan bunga dan pemacu pertumbuhan bunga baru. Pupuk ini merupakan pupuk daun yaitu pemakaiannya disemprot ke daun. Mekanisme kerja dari KNO3 yaitu KNO3 bekerja pertama kali melalui etilen (hormon bunga). Nitrat yang terkandung didalam KNO3 akan memperbanyak Enzim Nitrat Reduktase (ANR) pada daun 24 jam setelah pemupukan berlangsung. Penambahan nitrat pada amonia ini menjadi dasar kegiatan dari KNO3. Amonia diperlukan dalam metabolisme nitrogen untuk pembentukan asam amino, terlebih methionine, hormon pembentuk etilen, serta hormon pemacu pertumbuhan bunga (Amiroh, 2014). Spektrofotometri adalah suatu metode analisis yang berdasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang yang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dan detector vacuum phototube atau tabung foton hampa. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer, yaitu suatu alat yag digunakan untuk

menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun kualitatif dengan mengukur transmitan ataupun absorban dari suatu sampel sebagai fungsi dari konsentrasi. Pada titrasi spektrofotometri, sinar yang digunakan merupakan satu berkas yang panjangnya tidak berbeda banyak antara satu dengan lainnya, sedangkan dalam kalorimetri perbedaan panjang gelombang dapat lebih besar (Harjadi, 1990). Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang geombang tertentu. Panjang gelombang yang terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorbsi untuk mengukur perbedaan absorbsi untuk larutan sampel atau blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorbansi antara sample dan blanko ataupun pembanding (Khopkar, 2003). Cara kerja alat ini dimulai dengan dihasilkannya cahaya monokromatik dari sumber sinar. Cahaya tersebut kemudian menuju ke kuvet (tempat sampel/sel). Banyaknya cahaya yang diteruskan maupun yang diserap oleh larutan akan dibaca oleh detektor yang kemudian menyampaikan ke layar pembaca (Sastrohamidjojo, 1992).

IV. KESIMPULAN DAN SARAN A. KESIMPULAN Berdasarkan hasil dan pembahasan, maka dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: 1.

Enzim Nitrat Reduktase pada tanaman bertugas dalam mengkatalis reaksi reduksi nitrat menjadi nitrit dalam proses pengikatan molekul nitrogen oleh tumbuhan.

2.

Aktivitas Enzim Nitrat Reduktase pada tanaman Arachis hipogaea tertinggi pada perlakuan media urea yaitu sebesar 3.7419, diikuti berturut-turut oleh KNO3 yaitu sebesar 2.9739 dan Kompos yaitu sebesar 2.7127.

B. SARAN Saran untuk praktikum kali ini adalah prosedur praktikum harus diterangkan secara jelas dan lengkap sehingga proses berjalannya praktikum akan tertata dengan baik dan lebih mudah dilakukan.

DAFTAR REFERENSI Alnopri, Taufik, M., Ganefianti, D. W., Prasetyo & Mukhtasar., 2004. Modifikasi Rancangan Dialil untuk Mendapatkan Kopi Arabika Unggul Berdasarkan Aktivitas Nitrat Reduktase. Jurnal Akta Agrosia, 7(2), pp: 47-51. Amiroh, A., 2014. Pengaplikasian Dosis Pupuk Bokashi dan KNO3 Terhadap Pertumbuhan dan Hasil Tanaman Melon (Cucumis Melo L.). Saintis, 6(2), pp. 25-36. Daintith, J., 2005. Kamus Lengkap Kimia. Jakarta: Erlangga. Gardener, F. P., Pearce, R. B., & Mitcheli, R. L., 1991. Fisiologi Tanaman Budidaya. Jakarta: UI Press. Harjadi, W., 1990. Metode Analisa Kimia-Spektrofotometri. Jakarta: Gramedia. Khopkar, S. M., 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press. Lea, J. P., & Leegood, R. C., 1993. Nitrogen Metabolism in Leegood (eds.) Plant Biochemistry and Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons. Lehninger, A. L., 1993. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga. O’Brien, J. A., Andrea, V., Eleonore, B., Gabriel, K., Alain, G., Gloria, C., & Rodrigo, A. G., 2016. Nitrate Transport, Sensing, and Responses in Plants. Molecular Plant, 1(9), pp. 837–856. Padney, S. N., & Sinha, B. K., 1990. Plant Physiologi 2nd Revised Edition. Kanpur: Vikas Publising House. Parman, S., 2007. Kandungan Protein dan Abu Tanaman Alfalfa (Medicago sativa L.) setelah Pemupukan Biorisa. BIOMA, 2(9), pp. 38-44. Poedjiadi, A., 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Universtas Indonesia. Ruskandi, 1996. Tingkat Dosis Pupuk dalam Upaya Peningkatan Produktivitas Kapas. Jurnal Perspektif, 6(1), pp. 22–34. Salisbury, F.B., & Ross, C. W., 1995. Fisiologi Tumbuhan Jilid II. Bandung: ITB. Sastrohamidjojo, H., Yogyakarta.

1992.

Spektroskopi

Inframerah.

Yogyakarta:

Liberty