Aislamiento De Bacterias Del Suelo (1) (3).docx

AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEL SUELO Yamilet Arcos Arango ANA MARÍA GÓMEZ CHAVERRA LUISA FERNANDA VÁSQUEZ ARAQUE JULIANA GARCÉS VELÁSQUES LAURA RÍOS TOBÓN Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid – Facultad de Ciencias Agrarias RESUMEN Se aislaron bacterias del suelo con diluciones hasta 10-5, se colocaron en agar nutritivo de 90° y 37° con replica, se hizo conteo de las colonias; luego se realizaron tinciones: gram, se observaron bacterias gram positivas, asimismo realizamos tinción de esporas, se observaron esporas que se tornaron verdes; en Nigrocina encontramos estafilococos. Se cultivaron las bacterias en agar nutritivo, MacConkey, Eosina azul de metileno la cual solo creció la de agar nutritivo, finalmente; se aplicaron pruebas bioquímicas en el medio de cultivo con las pruebas TSI donde hubo fermentación, Citrato con resultado negativo, Urea igualmente con resultado negeativo y por último SIM donde la movilidad fue positiva. INTRODUCCIÓN Existen microorganismos que mejoran la fertilidad del suelo al fijar nitrógeno atmosférico en compuestos nitrogenados, utilizados por las plantas para sintetizar proteínas; convierten en el suelo sustancias orgánicas en compuestos inorgánicos haciéndolos disponibles para las plantas. Los microorganismos hacen una serie de reacciones bioquímicas, proporcionando materias nutritivas para el desarrollo de las plantas; se calcula que un pie de tierra fértil contiene cerca de 500 kilogramos de bacterias. (1) En sus hábitats naturales suelo, agua, sedimentos acuáticos y materia orgánica en descomposición, las poblaciones microbianas son siempre mixtas y muy diversas. Para determinar los caracteres fisiológicos de los distintos organismos asociados en estas floras tan complejas y poderlos identificar taxonómicamente, es indispensable aislarlos en cultivos puros, utilizando un método de

aislamiento, mediante disoluciones sucesivas, logrando así, cultivos puros de bacterias (3) Para estudiar debidamente los microorganismos se necesita como requisito previo el cultivarlos en condiciones de laboratorio. Para lograr esto, es preciso conocer cuáles son los nutrientes y las condiciones físicas que requieren. Mediante varios estudios, se han desarrollado diferentes medios de cultivo, debido a que las necesidades nutricionales de las bacterias varían de forma muy amplia, al igual que la composición de los medios empleados, éstas tienen diferencias notables según las condiciones del ambiente que favorecen su proliferación. (1) Para obtener energía y elaborar nuevos componentes celulares, los organismos tienen que disponer de materias primas o nutrientes, que son sustancias que se emplean en la biosíntesis y producción

de energía y en consecuencia son necesarias para el crecimiento microbiano. Factores ambientales como temperatura, nivel de oxigeno y concentración osmótica del medio son críticos para cultivar con éxito los microorganismos. (6)

y Azul de Metileno que actúan como inhibidores de la flora acompañante, especialmente de bacterias Gram positivas; por su contenido de lactosa, el agar sirve para discriminar entre las bacterias fermentadoras y no fermentadoras de este carbohidrato (4).

Según su especie, las bacterias son esféricas, en forma de bastón o de espiral. En algunas especies las bacterias se organizan en grupos, siendo los más comunes de ellos: pares (diplococos), racimos (estafilococos), cadenas (estreptococos) y filamentos (3). Aun que se puede decir que la microbiología comienza su gran desarrollo con la microscopia en cuanto a la ciencia, es indudable que los medios de cultivos y la utilización de agar marca otro importante punto en la ciencia microbiana; dentro de los medio de cultivo existentes, encontramos agar MacConkey (MCK), que contiene como inhibidores de la flora acompañante Gram positiva, sales biliares y cristal violeta; la lactosa, junto con el indicador de pH rojo neutro, sirve para la comprobación de la degradación de dicho azúcar, las colonias lactosasnegativas son incoloras y las lactosapositivas son rojas con halo turbio provocado por ácidos biliares al encontrarse en un pH ácido (4). El agar Nutritivo (AN), por las características de sus componentes, es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales, no contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. (7). El agar Eosina Azul de Metileno Lactosa (EMB), además de los nutrientes básicos, contiene los colorantes Eosina

La principal dificultad en el crecimiento bacteriano en los medios de cultivo, es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes; estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria; para esto se utilizan varias técnicas de tinción, tinción de Gram, cuyo fundamento se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. Las bacterias gram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano que es capaz de retener al complejo colorante-mordiente (cristal violeta-yodo). Durante la decoloración con alcohol acetona se provoca una deshidratación de esta gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando entonces al complejo en el interior de la célula; por el contrario, las gram negativas, poseen una delgada capa de peptidoglicano la cual no puede impedir la salida del complejo colorante mordiente y es entonces fácilmente teñida por el colorante secundario o de contraste (safranina) (8). Otra es la tinción de esporas (Sheaffer Fulton), las endosporas poseen unas

cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos.; además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción. La tinción específica de esporas requiere dos colorantes: verde malaquita (capaz de teñir las esporas en caliente) y safranina (colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas), las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante. (3) Algunos grupos de bacterias, pueden degradar una enorme variedad de sustancias orgánicas como ejemplo de su extraordinaria versatilidad metabólica. Así mismo mediante cultivos de enriquecimiento a partir de muestras tierra de jardín, se han aislado bacteria capaces de oxidar hormonas esteroides, de metabolizar sustancias antisépticas, como fenol, o desarrollarse a expensas de sustratos muy peculiares. Para diferenciar actividades metabólicas de las bacterias aisladas del suelo, se

usan diferentes medios de cultivo con sustratos como fuente de carbono, de energía, y otros nutrientes fundamentales para su crecimiento; se puede utilizar las siguientes pruebas bioquímicas: TSI (triple azúcar hierro), que permite identificar microorganismos fermentadores y no fermentadores de carbohidratos, ya que utiliza como fuente de energía lactosa, sacarosa, y glucosa; el agar SIM (sulfuro indol movilidad), permite evidenciar la presencia de ácido sulfhídrico, indol (capacidad de sintetizar enzimas), y movilidad; permite observar la movilidad que tiene la bacteria. La UREA, permite identificar la capacidad de la bacteria de desdoblar la urea como fuente de nitrógeno. El CITRATO, determina si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo (3). Existen muchos otros medios de cultivo que permiten caracterizar los microorganismos de acuerdo a sus características particulares.

MATERIALES Y MÉTODOS Para poder realizar el aislamiento de bacterias conocer su composición, su taxonomía o características, como combatirlas y demás, se debe obtener un trozo o pie de tierra con una profundidad aproximadamente de 20 cm ya que ésta, en sus capas más externas poseen poros y no permite conocer que tipos de microorganismos específicamente de este suelo. Al obtener el suelo se comienza una dilución desde 10-1 hasta 10-5 separando de a 1ml por tubo de ensayo y 9 ml de agua destilada estéril. Del último tubo de ensayo tomas 0.1ml y se sembró en 2 cajas Petri ya que la siembra se hace por duplicado, inicialmente se hizo la de 37ºC ya que esta dilución se pone al baño maría 5 min y de ahí se procede a hacer la otra siembra a 90ºC en Agar Nutritivo. Se incuba por un tiempo aproximado de 24 a 48 horas para saber el resultado que se obtuvo. Para continuar conociendo el tipo de bacterias con las que estamos trabajando se utiliza la tinción de Gram y estas se clasifican en coloración simple donde se utiliza el azul de metileno, en la coloración compuesta, se diferencia Gram positivas ( Figura 6) y Gram negativas( Figura 7) utilizando cristal violeta, lugol, alcohol acetona y safranina. Al igual que

la coloración diferencial donde se realiza la tinción de seaffer fulton utilizando el verde de malaquita (Figura 8); se utiliza para que las esporas se tiñan; la safranina para darle color rosa a las células mientras las endosporas permanecen verdes; la última coloración que se practicó fue la de Nigrosina (figura 11).

Conociendo el resultado de la anterior coloración procedemos a transportar los cultivos para conocer sus características, su metabolismo que tipo de reacciones puede causar en diferentes medios y para ello se utilizo el agar nutritivo, el agar de Eosina Azul de Metileno y Lactosa y Mac Conkey haciendo diferentes tipos de extendido como zig-zag, agotamiento y radial; se espera de 24 a 48 horas para revisar que tipos de resultado se obtuvo.

Ya finalizando se utilizaron diferentes tipos de pruebas como: TSI, citrato, urea, SIM y la prueba de catalasa para conocer los diferentes medios en los cuales estos crecen y se reproducen con mayor facilidad y son capaces de convivir en este medio; igualmente se debe esperar de 24 a 48 horas para observar el resultado.

RESULTADOS Los resultados que obtuvimos son los siguientes: En primera instancia, Se sembró en agar nutritivo con muestras a 37ºC (Figura 2-Figura 4) y a 90ºc,

realizamos diluciones a partir de suelo (Figura 1); posterior a esto, procedimos a sembrar en Agar (Figura 3-Figura 5); éstas muestras fueron tomadas el 25 de Agosto de 2012.

A partir de las colonias obtenidas, realizamos diferentes tipos de coloración, una de ellas fue Tinción de Gram, como lo demuestra la Figura 6-Figura 7, otra de las coloraciones realizadas fue Tinción

de sheaffer fulton (Figura 8); igualmente realizamos coloraciones simples (Figura 9–Figura 10) y una coloración compuesta (Figura 11), estas tinciones bacterianas se realizaron el 1 de Septiembre.

Figura 6: Tinción de Gram 37°C. Objetivo 100X

Figura 9: Coloración simple 37°C Objetivo 100X

Figura 7: Tinción Gram 90°C. Objetivo 100X

Figura 10: Coloración simple 37°C Obejtivo 100X

Figura 8. Tinción de sheaffer fulton

A continuación procedimos a sembrar en diferentes agares, Nutritivo, EMB y MacConkey, obtuvimos únicamente crecimiento en Agar nutritivo en zig-zag

Figura 11: Tinción de Nigrosina Observación de esporas 100X

como lo muestra la Figura 12, Estos resultados los obtuvimos el 8 de Septiembre.

En último lugar, se utilizaron diferentes medios de cultivo para diferenciar la actividad metabólica de las bacterias aisladas del suelo, en primer lugar se

sembró en TSI (Figura 13), luego en Citrato (Figura 14), posteriormente en Urea (Figura 15) y finalmente en SIM (Figura 16).

En la Tabla nº1 se muestran los diferentes tipos de siembra, en Tabla nº2 se evidencias los tipos de bacterias

halladas y finalmente en la Tabla nº3 se muestra los resultados de la Prueba de Catalasa.

Medio de cultivo

Positivo

Negativo * * -

TSI * Citrato Urea SIM * Tabla nº1. Diferentes tipos de siembra

Medio de cultivo TSI

Positivo

Citrato

(+)Klebsiella spp

Urea SIM

Proteus Vulgaris Cepas indol sin cambio de color Tabla nº2. Resultado bacterias

Tipo de prueba Catalasa

Negativo -

Resultados Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. ( - ) Escherichia Coli -

Resultado

Positiva

Negativa

Negativo

(+) Staphylococcus aureus

( - ) Streptococcus spp

Tabla nº3. Prueba de catalasa

ANÁLISIS DE RESULTADOS Al sembrar las bacterias aisladas del suelo se obtiene un crecimiento significativo del cual se deduce que hay mucha presencia de microorganismos en el suelo aislado y además encontramos bacterias termo resistente a altas temperaturas. Después de hechas las siembras en agar nutritivo e incubadas a 37ºc y expuestas a 90ºc se observo al cabo de 48 horas, las UFC, y muy pocas con formas regulares, por el contrario la mayoría con formas irregulares y había un gran numero de UFC. Al hacer las tinciones se observo la importancia de la decoloración con etanol-acetona que elimina el cristal violeta de las células Gram negativas pero no de las Gram

positivas. Las primeras adquieren un color de rosa a rojo tras la última tinción con safranina (6). Las bacterias Grampositivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares (8). En la tinción de esporas, Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción. La tinción específica de esporas requiere dos colorantes: 1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.

2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante (8), para este proceso se emplean cultivos en fase estacionaria. Al hacer diferentes sembrados en diferentes tipos de agares, no se observo crecimiento, mas específicamente en el agar Mac Conkey, ya que no todos los agares son aptos para todo tipo de bacterias ya que todas las bacterias crecen en un medio dependiendo de las condiciones ambientales y nutritivas que se les proporcionen dependiendo de la bacterias que se siembra. El agar Mac Conkey se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador

de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras (9). En este agar no se obtuvieron UFC, por lo tanto, se concluye que en el suelo aislado no hay presencia de bacterias Gram negativas. El agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de bacteria. Es muy útil porque permanece sólido incluso a relativas altas temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeñas. En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el líquido, y aparece como una sustancia espesa, con colonias difícilmente observables. El agar nutritivo contiene normalmente: 0,5 % de peptona; 0,3 % de extracto de carne/extracto de levadura; 1,5 % de agar; 0,5 % de cloruro de sodio; Agua destilada; pH casi neutro (6,8) a 25 °C. (10) En este agar, gracias a las condiciones nutricionales se obtuvo un crecimiento considerable de las bacterias del suelo aislado. El Agar Eosina y Azul de Metileno es un medio utilizado para el aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos Gram negativos. Este medio también es conocido como Agar EMB por sus siglas en inglés (11). En este medio no se observo crecimiento de colonias, por lo

tanto, no estaos frente a la presencia de bacilos Gram negativos. La caracterización bioquímica de entereobacterias y bacilos aislados del suelo se hizo inoculando los organismos en diferentes medios de cultivos con sustratos que pueden utilizar como fuente de energía, fuente de carbono y oro nutrientes esenciales para su crecimiento. Los medios de cultivo utilizados fueron: TSI: identifica microorganismos fermentadores y no fermentadores de carbohidratos ya que contiene glucosa, sacarosa, lactosa, rojo fenol como indicador de pH y sales de hierro. La fermentación de azucares esta dada por el cambio de color inicial al amarillo (12). Al realizar el cultivo en este medio se observó el cambio del color inicial al amarillo lo que indica que las bacterias aisladas son fermentadoras de lactosa y glucosa (A/A). Prueba del citrato: este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Esta prueba determina si un organismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono (12). Cuando se realizo la siembra en este cultivo obtuvimos un resultado negativo, ya que, no se observó ningún cambio de color ni crecimiento bacteriano, por lo tanto, se deduce que los microorganismos aislados no son capaces de utilizar el citrato como única fuente de carbono.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Prueba de la ureasa: determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco hará variar el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa (12). Al cultivar en este medio obtuvimos un resultado negativo, ya que, no hay cambio de color en el medio, lo que indica que, el organismo no tiene la capacidad de desdoblar la urea. Prueba de SIM: en esta prueba se observa movilidad; se evidencia la movilidad de las bacterias que la poseen, siempre y cuando no haya producción de acido sulfhídrico el cual dificulta la lectura. Se evidencia observando una sombra en forma de sombrilla en el medio (12). En esta prueba se hizo muy evidente la movilidad, no se evidenciaron la producción de acido sulfhídrico, lo que indica que no estas bacterias no tienen la capacidad de producirlo, ni la producción de indol, lo que indica que las bacterias aisladas no tienes la capacidad de sintetizar la enzima triptofanasa. En los procesos realizados se dieron a conocer las bacterias aisladas del suelo de San Antonio de Prado tomado a 20 cm de profundidad, en donde se evidencia la alta capacidad de movilidad y de fermentación de las bacterias Gram positivas, mas específicamente, de los bacilos.

1. Michael J.Pelczar. Microbiología, McGRAW-HILL Interamericana Editores S.A.1982 Páginas 2. http://es.pdfcoke.com/doc/5368278/Funda mentos-de-la-tincion-de-Gram 3. J.C.Senez. Microbiología General, DOINDEREM ET CIE. 1968 4. Lucy González Ortiz. Microbiología Médica, Gonzáles Ortiz, Lucy. 2.000 5. http://www.britanialab.com.ar/esp/produc tos/b02/nutritivoagar.htm 6. Lansing M. Prescott. Microbiología, McGRAW-HILL, 2002 7. http://www.britanialab.com.ar/esp/produc tos/b02/nutritivoagar.htm 8. http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/ SeminarioTinciones.htm 9. http://www.britanialab.com.ar/esp/produc tos/b02/maconkeyagar.htm 10. http://es.wikipedia.org/wiki/Agar_nutritiv o 11. http://www.mcd.com.mx/pdfs/AGAR%2 0EOSINA%20Y%20AZUL%20DE%20 METILENO.pdf 12. Guía de laboratorio de Yamilet Arcos