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Extracción y amplificación del ácido desoxirribonucleico (ADN) a partir de una muestra celular

Resumen: En el presente trabajo se tubo como objetivo principal realizar la extracción de ADN, ya que este es un ácido nucleico responsable de codificar toda la información genética que compone a un organismo viviente, para ello se uso la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) esta es una técnica de amplificación selectiva de un fragmento de DNA que aumenta el número de copias de una secuencia definida con la finalidad de su estudio y caracterización .

1. Introducción En la actualidad, el estudio de la variación genética, entre las poblaciones se plantea mediante marcadores moleculares, segmentos de ADN son o sin función conocida, que proporcionan información sobre la variación alélica y permiten distinguir individuos, para explicar procesos ecológico-evolutivos (Schlötterer, 2014). Estos marcadores se obtienen con técnicas como PCR (Polymerase Chain Reaction) y una secuenciación, lo cual hace posible analizar la variación en la molécula del ADN con un detalle sin precedentes (Hudson, 2015; Schlötterer, 2014). La aplicación de técnicas moleculares inicia con la extracción de ADN; y la obtención exitosa de datos confiables y reproducibles depende de la extracción de ADN puro e íntegro. El proceso de extracción de ADN, constituye el primer paso para llevar a cabo diferentes estudios que involucren a la biomolecular de ADN procedente de cualquier organismo vivo. Los pasos necesarios para la correcta extracción del ADN por medio de un procedimiento químicos son: 1. Lisis de las células o virus. Las sales caotropicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo sus desnaturalización. La adición de un detergente como SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas. 2. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa. La fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico.

3. 

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Purificación. Consta de tres fases Precipitación del ADN.- El ADN es insoluble en alcohol, por lo que su puede precipitar etanol frio o isopropanol y recuperar mediante una centrifugación. El alcohol del sobrenadante se llevara las sales añadidas previamente. Lavado de pellet.- Se realiza con alcohol frio volviendo a centrifugarse. Recuperación.- El sedimento se puede resuspender en H2O o tampón, tras ser secado completamente.

La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal. (UNAM)

2. Materiales y métodos El método utilizado para la extracción de ADN fue PCR, para el cual se utilizaron distintos materiales, sustancias y equipos, tales como: micropipetas de volumen variable, micropuntas de diferente tamaño, tubos de 15 ml, microtúbulos de 1,5 ml o 2 ml y gradillas; sangre en una porción de 2 ml, 4 ml de PBS, 1 ml de Agua destilada, 4 ml de TKM1, 50 ul de IGPAL CA-630, 320 de TKM2, SDS al 10%, 120 ul de CINa 5M, etanol al 99.9% y al 70% y

20 ul de TE-Buffer; y vórtex, centrifuga y microcentrífuga, respectivamente. Una vez terminados todos los pasos se procedió a dejar las muestras en incubación para poder al siguiente día hacer uso de las mismas y des esta manera poder calcular el ácido nucleico coeficientes de concentración y la pureza, a través de un espectrofotómetro nanodrop Ya obtenidos los datos se procede a su respectivo análisis Figura 3: Curva de concentración de DNA obtenida mediante el uso de un Espectrómetro NanoDrop. Concentración de DNA de 25,2 ng/µl Mediante el uso del Espectrómetro NanoDrop, lo resultados de esta primera muestra fueron: 7A1

Figura 1: Ejemplo de muestra de curva de concentración de DNA obtenida mediante el uso de un Espectrómetro NanoDrop.

3. Resultados

Concentración ng/µl A260 (10 mm path) A280 (10 MM path) 260/ 280 260/ 230

9,6

7A2 25,2

0,192

0,504

0,120

0,268

1,60 0,26

1,88 0,32

Curva de concentración de DNA: Muestra 7A1

Tabla 1: Coeficientes de concentración de ADN de ambas muestras.

Tabla 2: valores indicativos de pureza en muestras de ADN.

Figura 2: Curva de concentración de DNA obtenida mediante el uso de un Espectrómetro NanoDrop. Concentración de DNA de 9,6 ng/µl. Muestra 7A2

Los valores obtenidos en ambas muestran son: 7A1 7A2 - 260/ 280 1,60 1,88 - 260/230 0,26 0,32 Puesto que los resultados obtenidos son distintos a los valores normales de pureza, se puede decir que las muestras fueron afectadas por algún factor externo, alguna falla durante el procedimiento de extracción e incluso una mala medición de las sustancias que se usaron.

4. Discusión de los Resultados Mediante espectrofotometría se puede determinar la concentración y la pureza de una muestra de ADN basándose en la capacidad de absorbancia de un compuesto presente en una solución a una longitud de onda determinada. En el presente trabajo, se realizó la extracción del ADN a partir de sangre periférica y se obtuvieron las concentraciones de ADN que poseía cada muestra. En el caso de la muestra 7A1, con una concentración de 9,6 ng/µl, los valores de ADN obtenidos fueron: en el radio de 260/280, 1,60 y en el radio de 260/230 fue 0,26, estos datos están fueron del rango normal de pureza del ADN. En el caso de su gráfica, podemos observar que no presenta los picos ni valles que son característicos en una muestra típica de ácido nucleico (Fig. 1). En el caso de la muestra 7A2, cuya concentración fue 25,2 ng/µl, los valores obtenidos fueron: en 260/280, 1,88 y en 260/230, 0,32, valores que también se encuentran fuera del rango normal de pureza. Su gráfica presenta casi las mismas características que la muestra 7A1. Los resultados obtenidos en ambas muestras reflejan que el DNA sufrió una contaminación, al encontrarse por debajo de los valores normales. Esto puede deberse a un factor contaminante externo o a una mala medición de las sustancias usadas, entre otras posibles fallas. Comparando las gráficas, se tiene que un valor de absorbancia muy alto de 230 nm con respecto a la muestra es indicativo de contaminantes como carbohidratos, péptidos, fenoles, urea, ácido húmico o isotiocianato de Guanidina en la muestra. También puede ser el resultado de usar una solución incorrecta al hacer la medición en blanco.

5. Conclusiones 

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Al comparar los dos estudios podemos comprobar que empleando la misma técnica hay variaciones en las muestras ya sea por contaminación de material, mal empleo de técnicas o no seguir un protocolo establecido. En ambos casos hubo contaminación. El conocimiento de las técnicas de extracción de ADN es de gran

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importancia, ya que, estos constituyen el primer paso para el desarrollo de distintos estudios que involucren a esta biomolecula, además porque ayudaran al desarrollo de nuevas competencias en cuanto a procesos ecológicoevolutivos. La PCR ha facilitado también el diagnóstico de enfermedades hereditarias, permite también evaluar el riesgo de padecer transtornos autoinmunes.

6. Recomendaciones 

Antes de ingresar al laboratorio hacer el aseo correcto de las manos y usar la vestimenta adecuada para el ingreso a este.

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Llegar puntual a las instalaciones de esta manera aprovechar al máximo el tiempo en el laboratorio

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Después de terminar con la práctica es necesario dejar las cosas y los instrumentos utilizados en correcto orden y limpiar el lugar de trabajo.

7. Bibliografía Bibliografía Schlötterer, C. (2014). The evolution of mlecular makers-just a matter of fashion? Nature Reviewa , 63-69. Hudson, M. E. (2015). Secuencing brakthroighs for genomic ecology and evolutionary biology. Molecuar Ecology , 3-17. UNAM, L. d. (Ed.). Protocolo de Laboratorios. Mexico. Osorio, J., Pachajoa, H., & Hurtado, P. (2013). Concentración y pureza del ADN de muestras sanguíneas en papel Whatman FTA almacenadas entre 1 a 3 años. Revista Estolamologia , 35-38. BANCO NACIONAL DE ADN CARLOS III. (22 de Mayo de 2018). PROGRAMA CONTROL DE CALIDAD DE MUESTRAS. Obtenido de Universidad de Salamanca: http://www.bancoadn.org/docs/programacontrol-calidad-muestras.pdf