Acizi Nucleici

Structura acizilor nucleici Acizii nucleici sunt policondensati de nucleotide Nucleotid: baza azotata – pentoza - fosfat

Nucleotide

In polinucleotide, nucleotidele se leaga unul de altul prin legaturi fosfodiesterice 3’ – 5’. Rezulta lanturi cu polaritate 5’ – 3’

Nucleaze: hidrolaze care scindeaza (prin contributia unei molecule de apa) o legatura fosfodiesterica. DNAze (specifice pentru legaturile fosfodiesterice ale dezoxiribonucleotidelor); RNAze specifice legaturilor fosfodiesterice dintre ribonucleotide Exonucleaze: scindeaza numai un nucleotid terminal (specifice 3’ sau 5’) Endonucleaze: scindeaza o legatura fosfodiesterica distantata cu cel putin 2 nucleotide de terminus. Acidul dezoxiribonucleic (ADN, DNA) Vezi si: http://www.hhmi.org http://www.dnai.org DNA este suportul chimic al ereditatii (Avery, McLeod, McCarty, 1942) Doua categorii de date experimentale au dus la conceperea unui model structural al ADN 1.Echimolaritatea bazelor : C cu G, A cu T (Chargaff, 1950) 2. Fotografiile de difractie a razelor X a cristalilor de DNA (Wilkins 1953, Franklin 1953)

Perechile de baze G-C si A-T in forma tautomera majora fac structuri plane si egale ca marime (Watson, 1952)

Izolarea DNA din celule si analiza proprietatilor sale Extractia consta din: 1. Liza celulelor si a nucleelor (mecanica sau detergenti) 2. Precipitarea proteinelor (fenol sau alt precipitant) 3. Centrifugare 4. Precipitarea din supernatant cu alcool 5. Purificare prin centrifugare in gradient de clorura de cesiu (clasic) sau adsorbtia pe si elutia din rasini care retin numai acizii nucleici 6. Tratamentul cu RNAza (daca vrem sa izolam ADN) sau DNAza (daca vrem sa izolam ARN) Analiza : Fragmentare (enzime de restrictie) si electroforeza in gel de agaroza http://www.dnai.org

Sectionarea cu aceeasi enzima de restrictie a doua molecule de DNA pot duce (datorita portiunilor monocatenare – ‘lipicioase’) la colaje de fragmente si astfel la molecule noi de ADN (recombinant)

Denaturarea reversibila a DNA:

animatii F://animatii http://www.dnai.org/d/index.html http://en.wikipedia.org http://en.wikipedia.org-DNA-Wkipedia http://en.wikipedia.org-DNA – Fuorescent in situ hybridization – Wkipedia Manipulations, Techniques, PCR, secventare Sinteza in vitro a DNA prin reactia PCR (Mullis, 1986)

Secventarea ADN prin tehnica terminarii lantului prin folosirea 2,4 di-dezoxi NTP (Sanger, 1950 cu modificari ulterioare) http://www.dnai.org/d/index.html

http://en.wikipedia.org http://en.wikipedia.org-DNA-Wkipedia http://en.wikipedia.org-DNA – Fuorescent in situ hybridization – Wkipedia

DNA polimeraze DNA polimeraze DNA dependente: Procariote: DNA polimeraza I (E. coli), procesivitate mica, 5’ exonucleaza asociata, 3’exonucleaza asociata DNA polimeraza II (E.coli) procesivitate mica DNA polimeraza III (E. coli) inalt procesiva, 3’exonucleaza asociata DNA polimeraza IV (E.coli) procesivitate mica, poate face sinteza translezionala a dimerilor de timina DNA polimeraza V (E coli) procesivitate mica, fidelitate mica, face sinteza translezionala cu greseli Taq polimeraza (Termus aquaticus) procesivitate mica, 5’polimeraza asociata Eucariote: DNA polimeraza α (cu centru catalytic suplimentar de ARN polimeraza (primaza); neprocesiva DNA polimeraza β neprocesiva DNA polimeraza γ (mitocondrialla) DNA polimeraza δ inalt procesiva, centru catalytic 3’exonucleazic DNA polimeraza ε inalt procesiva, centru catalytic 3’ exonucleazic DNA polimeraza η procesiva, poate face sinteza translezionala T-T fara eroare DNA polimeraza ζ procesiva, face sinteza translezionala cu erori DNA polimeraze RNA dependente (revers-transcriptaze) Caractere comune: Toate adauga nucleotide (din nucleozid trifosfati) la extremitatea 3’ a unui primer, conform unui model monocatenar) Toate au nevoie de un model (DNA in cele mai multe, ARN la revers-transcriptaze) Toate au nevoie de un primer (ADN sau ARN) complementar cu modelul Diferente:

Functii enzimatice suplimentare (datorate unor centri catalitici diferiti de cel polimerazic) 5’ exonucleazic 3’ exonucleazic Fidelitate Procesivitate (datorata unei subunitati speciale numite factori de procesivitate), uneori folosita alternativ de una sau alta din polimeraze (de exemplu polimeraza eucariota delta si polimeraza eta folosesc acelasi factor de procesivitate PCNA, dar nu simultan. Capacitatea de a sesiza sau nu leziunile Capacitatea de a adauga (sau nu) un nucleotide suplimentar la catena sintetizata dupa terminarea modelului Molecule DNA in vivo Molecule circulare (in special la procariote) : cromozomi bacterieni (sute de mii de perechi de nucleotide), plasmide (mii de perechi de nucleotide)

Cromosomi la eucariote : DNA linear cu extremitatile celor doua catene sudate. DNA cromosomal este impachetat cu proteine, sub forma de cromatina

Structurile DNA in vivo nu au capete libere. Impachetarile duc la suprahelicare (numar de treceri ale unei catene asupra celeilalte diferite de cele de echilibru. Superhelicare negativa (numar mai mic de treceri decit cel de echilibru) sau pozitiva (numar mai mare de treceri). Forma obisnuita de superhelicare – superhelicarea negativa.

Formele superhelicate (pozitiv sau negativ) si cele relaxate ale aceleiasi molecule de DNA – topoizomeri. Topoizomerazele catalizeaza trecerea de la un topoizomer la altul.

Topoizomeraze: Enzime care catalizeaza trecerea unui topoizomer: de exemplu DNA superhelicat, adica avind un n –linking number-diferit de cel de echilibru in DNA relaxat, cu n – linking number- apropiat de cel de echilibru Topoizomeraze I (fac rupturi monocatenare temporare si sudare dupa relaxare) Topoizomeraze II (fac rupturi bicatenare si resudare dupa relaxare sau superhelicare dependenta de ATP) Sinteza DNA in vivo (replicarea). Se face dupa modul semiconservativ (ca si sinteza in vitro). Ca si la sinteza in vitro, este nevoie de dezoxinucleozid trifosfati (A,G, T, C), model monocatenar, DNA polimeraza si primeri. Primerii sunt sintetizati ca scurte catene de ARN construite de o ARN polimeraza (care poate sintetiza pornind de la primul nucleotid) numita primaza. Monocatena model se obtine prin denaturarea catalizata a ADN bicatenar. Catalizatorii sunt enzime numite helicaze.

In vivo, furca de replicare se deplaseaza in aceeasi directie pentru ambele catene, desi catenele sunt antiparalele si DNA polimerazele nu adauga nucleotide decit la extremitatea 3’ a catenei care se alungeste, spre polul 5’ a catenei model. Aceasta face ca una din catene (care se alungeste in directia de deplasare a furcii de replicare) sa se poate replica continuu, cealalta (care se alungeste in sensul invers furcii de replicare) nu se poate replica decit discontinuu, sub forma fragmentelor Okazaki (cu sinteza de primer RNA de fiecare data)

Catena cu sinteza discontinua (lagging) se poate alungi in directia furcii de replicare numai daca catena model dupa care se copiaza este cudata. Cudarea se poate face prin montarea si demontarea (pentru fiecare fragment Okazaki) a factorului de procesivitate (β clamp, PCNA) pe si de pe subunitatea catalitica a polimerazei care face sinteza discontinua (lagging strand)

Fragmentele Okazaki sunt prelucrate (li se detaseaza partea ARN), alungite de o polimeraza cu procesivitate mica si sudate prin DNA ligaza

DNA ligaza actioneaza intr-un mod asemanator cu topoizomerazele de clasa I

Fidelitatea replicarii DNA Probabilitatea de a introduce un nucleotid gresit este in jur de 10-9. Ea este atit de mare in ciuda faptului ca: - erorile datorate numai formelor tautomere ale bazelor ar avea frecventa de ordinul 10-5 -agitatia termica ar duce la ruperea legaturilor N- glicozidice la un numar de aprox. 10-4 – 10-5 situri abazice. In timpul replicarii, acele situri ar putea fi complementate cu orice nucleotid, corect sau gresit. -factori fizici (radiatia UV, radiatiile ionizante, chimicale ca acidul nitros si derivatii sai, agentii alkilanti, hirocarburile policiclice (din fum, gudroane, etc) pot modifica un numar variabil de baze azotate. In acest caz, in cursul replicarii, aceste baze modificate ar putea duce la complementarea gresita pe catenele noi sintetizate. Aceste efecte sunt contracarate de: -

Functia editoare (3’-exonucleazica) a DNA polimerazelor (mai ales in cazul erorilor produse de formele tautomerice minore a bazelor azotate (care dureaza foarte putin in timp

-

Procese de reparare a leziunilor

Leziunile DNA si repararea lor 1. Oxidari (raze UV, derivati ai acidului nitros) Dezaminare

2.Alkilari (metil metan sulfonat, gaz mustar si alti agenti alkilanti)

3. Legaturi covalente nenaturale intre baze azotate (raze UV)

4. Rupturi monocatenare (UV, procese ale metabolismului DNA) 5. Rupturi bicatenare (radiatii ionizante, rupturi in timpul replicarii, etc)

Raspuns la leziunile DNA Raspuns Oprirea ciclului celular (prin mecanismele de ‘check-point’ al integritatii genomului Repararea ADN 1. Repararea neinperecherii de baze (MMR) Repararea ADN 2. Repararea prin excizie de baze (BER) Repararea ADN 3. Repararea prin excizie de nucleotide (NER) Repararea DNA 4. Repararea rupturilor bicatenare Apoptoza Mutatii, eventual transmisibile la descendenti

Ce se intimpla in lipsa raspunsului (boli genetice care predispun la cancer) Ataxia-telangiectazia Cancer de colon non-polipozic familial

Xeroderma pigmentosum, diferite variante Sindromul Bloom, sindromul Werner, sindromul Nijmegen Sindromul Li Fraumeni, cancere variate Boli genetice diverse

Repararea prin folosirea altui duplex ca model (repararea prin recombinare)

Acizii ribonucleici (ARN, RNA): lanturi de ribonucleotide

Existenta functiei alcoolice la 2’ face ca ARN sa fie diferit de AND in urmatoarele privinte:

1. 2.

Legaturile fosfodiesterice la ADN sunt mult mai stabile decit cele de la ARN (labilizate de vecinatatea functiei hidroxil la 2’) ARN are proprietati catalitice, datorita aceleiasi functii hidroxil de la pozitia 2’ a ribozei. ARN poate cataliza reactii de transesterificare si transpeptidare

Majoritatea moleculelor de ARN sunt monocatenare; exista si ARN bicatenar

Specii de ARN in vivo ARN monocatenar Nuclear

Citoplasmatic

hnRNA (heterogen)==

mRNA (mesager)

RNA nucleolar

rRNA (ribosomal)

snRNA tRNA (transfer) ARN regulatori Pre miRNA (monocatenar, nuclear), siRNA sau miRNA/miRNA (bicatenar, citoplasmatic)

Sinteza ARN

Se face prin transferul unuia din cele 4 nucleotide componente: Adenilic, Guanilic, Citidilic, Uridilic de la ATP, GTP, CTP sau UTP la hidroxilul 3- a unui nucleotid (sau polinucleotid) anterior. Extremitatea 5’ a unui ARN nou sintetizat este intotdeauna un nucleozid trifosfat. N1TP + N2TP -- N1TP – N2P + PPi Reatia este catalizata de RNA polimeraze RNA polimeraze : ADN dependente

ARN dependente sau ARN replicaze (caz particular, in special la celulele vegetale) rezultind intr-un ARN bicatenar care poate fi fragmentat in RNAi (scurte molecule de ARN bicatenar de catre complexul Dicer existent in toate celulele eucariote) Copiile de ARN ale DNA sunt partiale si folosesc una sau cealalta catena a DNA. Se pune problema selectiei copierii : selectia catenei, selectia locului de incepere si de terminare a copierii (transcriptiei). Secventa de DNA numita promotor semnalizeaza inceputul transcriptiei si atasarea proteinelor participante. Proteinele participante sunt factorii generali de transcriptie (aceiasi pentru toate transcriptele uneia din polimeraze) si factori regulatori de transcriptie (diferiti pentru grupe de gene diferite)

In jurul casetei TATA a promotorului se ataseaza factorii generali de transcriptie. Factorii regulatori se ataseaza de alte secvente, in general in amonte de caseta TATA.

Initierea transcriptiei are nevoie de helicaze, topoizomeraze si factori generali de transcriptie intre care proteinele care recunosc caseta TATA (s la procariote, TBP la eucariote) si ARN polimeraza. Ceilalti factori generali de transcriptie au diferite roluri in constituirea complexului de initiere.

Dolan : http://www.dnai.org/d/index.html http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm Transcriptele primare se prelucreaza in nucleu si citoplasma pina ajung la ARN matur: mRNA, rRNA, tRNA si alte forme (de exemplu, siRNA). Aceste prelucrari sunt catalizate de ARN insusi (ribozim)

Precizia eliminarii intronilor este asigurata de molecule de ARN (U1 – U6) din categoria snRNA

http://en.wikipedia.org ` Reglarea expresiei genice Prin ritmul transcriptiei

Prin reglarea duratei de viata a ARN. La aceasta reglare participa forme de ARN bicatenar (miRNA si siRNA) care au precursori nucleari

Text explicativ la aceasta imagine se poate gasi pe wikipedia/RNA http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm Codul genetic Alfabetul de 4 litere al DNA trebuie sa codifice 20 de aminoacizi. Aceasta se poate face doar prin grupare Daca fiecare nucleotide ar codifica un aminoacid cele 4 nucleotide ar putea codifica 4 nucleotide Daca un grup de doua nucleotide (din 4) ar codifica un aminoacid atunci toate combinatiile de 2 nucleotide ar putea codifica 42 = 16 aminoacizi Daca un grup de trei nucleotide (din 4) ar codifica un aminoacid atunci toate combinatiile de 3 nucleotide ar putea codifica 43 = 64 aminoacizi Mai mult decit sufficient pentru cei 20 aminoacizi + citeva semne de punctuatie

Un triplet de nucleotide este unitatea de cod = codon Codonii sunt juxtapusi sau suprapusi? Exista semne de punctuatie care sa separe codonii? Care sunt codonii pentru fiecare aminoacid? (Nirnberg, Chorana, Ochoa, 1960-1966) http://www.dnai.org/d/index.html

Moleculele si structurile supermoleculare care iau parte la biosinteza lanturilor polipeptidice (procesul de translatie a mesajului genetic) 1.

ARN mesager (mesajul)

2.

Conjugatul aa-tRNA (decodorul)

Reactia aminoacil – tRNA sintetazei

3. Ribosomul (masina decodoare)

Sinteza lanturilor polipeptidice (translatia informatiei genetice) Etape: 1. 2.

Initiere Subunitatea mica se asociaza cu mRNA si cu tRNAmet initiator plasat in situl P impreuna cu codonul initiator de pe mRNA. Apoi asociaza si subunitatea mare Alungire Se intimpla in cicluri; fiecare ciclu rezultind in adaugarea unui nou aminoacid la aminoacidul initiator (ciclu 1) sau a unui lant polipeptidic cu n aminoacizi (ciclul n)

3.

Terminare Se intimpla cind in situl A al ribosomului apare un codon ‘stop’ nerecunoscut de nici un anticodon ci de un factor proteic de terminare. Lantul polipeptidic se desface de ultimul tRNA si subunitatile ribosomului disociaza

1.

Initiere

Antibioticele si toxinele ca inhibitori ai sintezei de polipeptide Eucariote (citoplsama)

Eucariote

Procariote

(Mitocondrii) Initiere : Acid aurin tricarboxilic Elongare : Puromicina Acid fusidic Cloramfenicol Cycloheximida Tetraciclina Toxina difterica Terminarea : Eritromicina Streptomicina

Nu inhiba

Nu inhiba

Inhiba

Inhiba Nu inhiba Nu inhiba

Inhiba ? Inhiba (transpeptidarea)

Inhiba (transpeptidarea) Nu inhiba Inhiba (translocarea)

Nu inhiba Inhiba Nu inhiba

Inhiba Inhiba Inhiba (transpeptidarea) Nu inhiba Inhiba Nu inhiba

Nu inhiba Inhiba

Inhiba ?

Inhiba Inhiba

Efectele mutatiilor punctuale din DNA asupra proteinelor codificate Mutatii punctuale: 1.

Substitutii (un nucleotid inlocuit prin alt nucleotid) Efecte posibile: a. Nici un effect b. Inlocuirea unui aminoacid cu alt aminoacid (mutatie missense – sens gresit) c. Scurtarea prematura a lantului (mutatie nonsens, datorita transformarii unui codon sens (codifica aminoacid) in codon ‘stop’)

2.

Insertii/deletii (mutatii cu alterarea cadrului de lectura) Efecte: a. Alterarea completa a secventei de aminoacizi inspre extremitatea C, pornind de la locul mutant; b. Lant polipeptidic mai scurt sau mai lung, ca effect al schimbarii cadrului de citire

Soarta lanturilor peptidice dupa sinteza lor