6.- Cromatografia En Columna

PRÁCTICA # 6 “CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA” OBJETIVOS: • • •

Conocer la cromatografía en columna como técnica de separación de mezclas de sustancias, sus características y los factores que en ella intervienen. Utilizar la cromatografía en columna para la purificación de una sustancia contaminada con un colorante. Controlar con cromatografía en capa fina el proceso de separación de mezclas por cromatografía en columna.

INTRODUCCIÓN: Las técnicas cromatográficas se emplean para separar los componentes individuales de una mezcla y, en ciertos casos, para identificar un compuesto comparando su comportamiento cromatográfico con el de sustancias conocidas empleadas como patrón. La base de la técnica es que cuando un determinado soluto interactúa con dos fases, una de ellas, habitualmente sólida, llamada fase estacionaria, experimenta una serie de procesos (adsorción en fase sólida, solubilización en cada fase, arrastre por la fase móvil, etc.) que, en último extremo, llevan a que el soluto se reparta entre ambas fases. En el equilibrio, la relación entre las concentraciones del soluto entre ambas fases es constante, y se denomina coeficiente de reparto. Si en una mezcla, cada componente tiene un coeficiente de reparto diferente del de los otros, la separación será buena. Naturalmente, dicho coeficiente depende de la naturaleza de las fases, así como de las condiciones de la cromatografía. Una de las técnicas cromatográficas más sencillas es la que se realiza en capa fina, llamada así porque la fase estacionaria es una capa fina de un material poroso (gel de sílice, alúmina, etc.) extendida para su manejo mecánico sobre un soporte inerte. La fase móvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones, que emigra por la fase estacionaria debido, sobre todo, a la capilaridad. En su movimiento, arrastra más o menos a los componentes de una mezcla en función de sus mayores o menores coeficientes de reparto. El coeficiente de reparto es poco empleado en la práctica. En su lugar, y relacionado con él, se emplea el denominado Rf, característico de cada sustancia, definido como la relación entre la distancia que recorre dicha sustancia y la que recorre la fase móvil. Las más insolubles tendrán, en el disolvente empleado, un Rf próximo a cero, mientras las más solubles se acercarán a uno. Cromatografía en columna: Se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una columna. La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicación de presión (cromatografía flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de ésta un poco de algodón o lana de vidrio, para evitar que la sílica o la alúmina queden retenidas en la columna y que el disolvente se engrasada hasta el nivel del soporte. A continuación se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogiéndose por lo general en tubos de ensayo. Una columna de cromatografía es un tubo de vidrio relleno con una sustancia sólida de propiedades adsorbentes constituida por pequeñas partículas: gel de sílice y alúmina son las más usadas. Este relleno es lo que se conoce en cromatografía como la fase estacionaria. A través de la columna se hará pasar una corriente de un disolvente o mezcla de disolventes denominada eluyente y/o fase móvil. La mezcla de compuestos a separar se disuelve en una pequeña cantidad de disolvente y se coloca sobre el adsorbente, en la parte superior de la columna, quedando adsorbida por el mismo. A continuación se pasa un flujo de eluyente a través de la columna. Los compuestos constituyentes de la mezcla son arrastrados por el eluyente a su paso, haciéndoles avanzar a lo largo de la columna. Sin embargo, no todos los compuestos avanzan a la misma velocidad, y esta es precisamente la clave de la cromatografía. Algunos compuestos se ven más fuertemente retenidos por el adsorbente (fase estacionaria) y por lo tanto avanzarán más despacio. Por el contrario, otros apenas son retenidos y avanzarán a mayor velocidad. En general se dice que la separación en la cromatografía se basa en la afinidad diferencial de los distintos compuestos por la fase móvil o la fase estacionaria.

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El orden aproximado de elución de compuestos y de polaridad es aproximadamente el que se indica:

Cromatografía en Capa fina La separación de mezclas de moléculas mediante la cromatografía de capa fina se basa en el principio del reparto entre dos fases. En general, una cromatografía se realiza permitiendo que la mezcla de moléculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase móvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a través de ésta para "lavar" (eluír) a las moléculas en la muestra. Debido a que las distintas moléculas en la muestra presentan diferente coeficiente de reparto, la fase móvil "lavará" a los distintos componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en la fase móvil serán eluídos más rápido que los que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria. En la cromatografía de capa fina, la fase estacionaria es una delgada capa de un soporte sólido granulado, tal como gel de sílica, alumina, ácido silícico u otros, que se depositan sobre una placa de vidrio, aluminio u otro soporte inerte. Para que adquiera firmeza y no se desmorone, la capa de fase estacionaria se aglutina con una pequeña cantidad de sulfato de calcio u otro agente cementante. Las muestras se aplican añadiendo pequeñas gotas de solución en un pequeño círculo cerca del extremo inferior de la placa. La gota se deja secar y si se desea poner más muestra se pueden aplicar más gotas, cuidando de que la mancha no se haga demasiado grande. La placa seca se sumerge en un pequeño volumen de fase móvil (mezcla de solventes). La polaridad de la mezcla de solventes se elige de acuerdo a la mezcla de compuestos que se desea separar. En cromatografía de capa fina la fase estacionaria está hidratada, por lo que se le considera como la fase polar. Como sólo la base de la placa queda sumergida, el solvente comienza a mojar la fase estacionaria y asciende por capilaridad. Al recorrer la placa la fase móvil va arrastrando a las substancias apolares y aquellas más polares son retenidas por la fase estacionario dando lugar a la separación. La placa desarrollada se deja secar y se revela con un reactivo que tiña a las substancias de interés. La movilidad relativa o Rf es la relación entre la distancia recorrida por la mancha de un compuesto, dividida por la distancia recorrida por el frente de solvente al momento de sacar la placa del solvente. La técnica de cromatografía en capa fina (TLC), entre otras cosas permite:

∼Determinar el grado de pureza de un compuesto ∼Comparar muestras

∼Realizar el seguimiento de una reacción ∼Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografía de columna Cromatografía en columna (por fase inversa): Esta es una cromatografía de interacción en la que la fase estacionaria, con moléculas hidrofóbicas, interactúa con moléculas hidrofóbicas en la muestra. La matriz consiste de fibras de silicato con cadenas de hidrocarburos. Estas atraerán a las moléculas hidrofóbicas de la muestra mientras que las hidrofílicas salen con el amortiguador. Las moléculas son eluídas de la columna lavando con soluciones de distinta concentración de alcohol o cualquier otro solvente no polar. = PARTE EXPERIMENTAL= MATERIAL: Frasco vial de 15 ml 8 Colector Placas p/cromatografía 10 Embudo de vidrio (portaobjetos) 2 Pipeta Pasteur

1 1 1

2

Vasos de pp. de 250 ml Vasos de pp. de 150 ml Pinzas de 3 dedos c/nuez Baño maría. eléctrico c/extensión Refrigerante de agua c/mangueras Matraz pera de una boca T de destilación Tapón quickfit

1 2 1 1 1 1 1

Espátula Columna p/cromatografía Frasco cámara Probeta de 25 ml Varilla de vidrio(50 cm. de longitud) Capilares Algodón Lámpara de luz U.V

1 1 3 1 1 4

SUSTANCIAS: Azul de metileno gel de sílice para columna gel de sílice p/cromatografía en capa fina acetato de etilo hexano sulfato de sodio anhidro yodo EQUIPO: Rotavapor, Parrilla de calentamiento.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

° Se le proporcionará 0.5026 g de una mezcla de ácido benzóico/azul de metileno, de la cual separará el producto principal, por cromatografía en columna. ° Para empacar la columna sujétela en el soporte con las pinzas. Engrase la llave y manténgala en posición de cerrado.

° Prepare una suspensión de 10g de alúmina para columna en 10mL de AcOEt y agite durante 5 minutos para eliminar las burbujas.

° A través del embudo vierta la suspensión en la columna golpeando ligeramente con los dedos para que el empacado sea uniforme.

° Abra la llave para eliminar el exceso de disolvente teniendo cuidado de no dejar secar la alúmina. ° En el vaso de 150 mL disuelva la mezcla problema con la mínima cantidad de AcOEt, y ayudándose con el agitador viértala con cuidado, para que quede colocada uniformemente por encima de la alúmina, abra la llave para que salga el eluyente y se adsorba la muestra aplicada, cuidando que no se seque la alúmina, eluya la mezcla con AcOEt. Agregue 0.5cm de Na2SO4.

° Colecte las fracciones (eluatos) de 10 mL de los frascos viales y controle la separación, haciendo c.c.f. a cada una de las fracciones ante una muestra de referencia (testigo).

° Eluya las cromatoplacas en mezcla de Hexano-Acetato de Etilo (1:1), revele con luz U.V. ° En cada cromatoplaca observe el cambio de la intensidad de la coloración de la mancha del producto principal. La elución y la separación terminan en el momento en que no aparece mancha.

° En un matraz reúna las fracciones que contienen la misma sustancia.

° Para recuperar la sustancia destile el exceso de disolvente, utilizando una destilación simple, calentando con un baño maría eléctrico, deje en el matraz pera un residuo de 5 mL aproximadamente y viértalo en un vaso que termine de evaporar en la campana.

° Pese el producto recuperado, calcule el rendimiento. RESULTADOS: Matraces: Se realizaron 6 eluatos:

Placas: (s = testigo de ácido benzóico), eluyente: Hex /AcOet (6:4)

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Ya que solo subieron las muestras 1, 2 y 3, estas fueron las que se mezclaron y se aplico la destilación simple, para obtener la muestra final de ac. Benzóico. Muestra original: 0.5026g Muestra pesada: 0.2521g

%R =

0.2521g ×100 = 50.16% 0.5026 g

DISCUSIÓN DE RESULTADOS:  Se utilizó la técnica de cromatografía en columna para separar individualmente al ácido benzóico de el azul de metileno con el que se encontraba mezclado, identificándolo comparando su comportamiento cromatográfico con el de la sustancia patrón de ácido benzóico puro eluido en AcOet.  Se realizaron 6 eluatos de entre 10ml cada uno que se colocaron en 3 cromatoplacas para realizar cromatografía en capa fina, 2 por cada una y en medio se colocó el testigo de ácido benzóico para determinar dependiendo de las muestras que subieran en cuáles de ellas existía aún ácido benzóico.  En las muestras 1 y 2 fue en las que se observó más muestra, también en la 3, pero ya era mínima la cantidad y en la 4 apenas se observaba un pequeño punto, la 5 y la 6 ya no se observaba muestra, así que se mezclaron las muestras 1,2 y 3, para después separar el eluyente del ácido por destilación simple y así obtuvimos una muestra final de 0.2521g de una muestra inicial de 0.5026g con un rendimiento del 50.16%, esto posiblemente debido a que la muestra inicial contenía demasiado azul de metileno mezclado en ella y esta parte se quedo en la columna, o también existe la posibilidad de que el eluato 4 tuviera también un poco más de muestra, aunque hubiese sido mínima ya que en la placa no se observo que hubiese gran cantidad de muestra, por lo que obtuvimos ese rendimiento de la mitad de la muestra original.  En cuanto al azul de metileno, este quedo retenido por el adsorbente (fase estacionaria), lo que permitió separarlo del acido benzóico. CUESTIONARIO: 1. Si una mezcla de antraceno y naftaleno se separa por cromatografía sobre alúmina, ¿cuál de los dos hidrocarburos eluirá primero y cuál al último? ¿Cuál sería el más polar? Primero eluirá el antraceno

luego el naftaleno debido a que el primero es mas polar que el segundo esto es originado por la triple estructura cíclica-aromática sobre la doble estructura cíclica-aromática del segundo 2. Un colorante desconocido, se piensa que puede ser azul de metileno, ¿cómo se podría comprobar esta suposición usando un procedimiento basado en una técnica cromatográfica? Por medio de la

separación de las diferentes fases además de utilizar los disolventes que sean los más adecuados para disolver este colorante por medio de cromatografía en capa fina identificando el número de fases correspondiente al azul de metileno y si éstas fases corren igual al ser comparadas con un testigo de azul de metileno, podría tratarse de la misma sustancia. 3. ¿Qué debe hacerse para encontrar el eluyente adecuado para una sustancia en una cromatografía en columna? De acuerdo a la polaridad de la muestra se determina la polaridad del eluyente y

determinar las demás fases que rodean la columna para evitar que la muestra no se desplace más de lo necesario 4.- La recuperación cuantitativa del producto principal, ¿sería más completa si se recogieran fracciones mayores o menores de 10 mL? ¿Por qué? Mayores de 10 ml para que mayor parte de la muestra

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pase por la columna y así se juntarían las fases para realizar la destilación y obtuviéramos mayor cantidad de muestra final 5. Indique alguna de las aplicaciones de la cromatografía de adsorción en columna y capa fina

Capa fina : separación de aminoácidos Columna : separación de colorantes, proteínas 6. Escriba la ficha bibliográfica completa de 5 libros de cromatografía en capa fina y columna (técnica y teoría) especializada:

° ABBOTT,

David y ANDREWS, R. S. Introducción a la Cromatografía. 3ra. Edición. Colección Exedra. Editorial Alhambra. España. 1973.

° BAUER, Karin ; GROS, Leo and SAUER, Werner. Thin Layer Chromatography: An Introduction. Hüthig Verlag. Germany. 1991 ° BROWNING, D. R. Cromatografía-Toray-Masson. España. 1971. ° DOMINGUEZ, Xorge Alejandro. Cromatografía en Papel y en Capa Delgada. Serie de Química. Organización de los Estados Americanos. Nº 16. U.S.A. 1975 ° GÖTZ, Wolfgang; SACHS, Albert and WIMMER, Hans. Thin-Layer Chromatography. Gustav Fisher. Verlag. Germany. 1980.

° JORK, H and WIMMER H. TLC Report: A Collection of Quantitative Papers. GIT Verlag. Germany. 1986. ° Reactivos de Coloración para Cromatografía en Capa Fina y en Papel. Merck. Alemania. 1980.

° TOUCHSTONE, Joseph and DOBBINS, Murrell F. Practice of Thin Layer Chromatography. 2nd Edition. Willey Interscience. U.S.A. 1983.

° ZLATKIS, A. and KAISER, R.E. HPTLC. High Performance Thin-Layer Chromatography.

Vol. 9. Journal

of Chromatography Library. Elsevier. 1977. 7. Cuál es la diferencia entre cromatografía en capa fina y la cromatografía en papel.

Igual que la realizada en papel, la cromatografía en capa fina se basa en la distribución en dos fases, la estacionaria, compuesta por una capa de hidratación y la móvil, que se trata de un solvente orgánico. La única novedad radica en el soporte, ya que no es una hoja de papel, sino una capa de 0,1 a 1 mm de óxido de silícico o celulosa, apoyada en un subsoporte de cristal. La capa se aplica manualmente mediante un aparato que deja una ranura regable por la que sale la pasta denominada Silicagen, este aparato la vamos deslizando por la placa a velocidad constante para conseguir la textura deseada, no hay que decir que a mayor velocidad menor grosor de la capa. Siempre se realiza de forma ascendente, principalmente por que el soporte es rígido. La cromatografía en capa fina aguanta tratamientos de visualización mucho más potentes debido al subsoporte y que es más rápida, pudiendo terminar la corrida en una media hora. 8. Indique la toxicidad de las sustancias que utilizó y como se podrían desechar:

AZUL de METILENO: C16H18ClN3S . 3H2O PM: 373,9 anhidro. (PM: 319,9) Cloruro de metiltioninium, colorante azul antiséptico utilizado en aplicaciones locales en la piel y en las mucosas, y por vía bucal como desinfectante urinario. Cristales o polvo cristalino de color verde oscuro, con brillo bronceado. Inodoro o prácticamente inodoro. Estable al aire. Sus soluciones en agua o en alcohol, son de color azul profundo. Soluble en agua y en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol. Toxicología: reacciones de hipersensibilidad (alergia), tales como ronchas en la piel, hinchazón, dificultad para respirar.irritación local, sensación de quemaduras, picazón. Los síntomas de sobredosis corresponden a una intensificación de los efectos adversos descritos, tales como: ansiedad, dolor en el pecho, dificultad para respirar, confusión, dolor de cabeza, dolor de piernas, nauseas, vómitos. Debe recurrir a un centro asistencial para evaluar la gravedad de la intoxicación y tratarla adecuadamente. ACETATO DE ETILO: Líquido incoloro, de olor característico. El vapor es más denso que el aire y puede extenderse a ras del suelo; posible ignición en punto distante; El calentamiento intenso puede originar combustión violenta o explosión. La sustancia se descompone bajo la influencia de luz UV, bases y ácidos. La solución en agua es un ácido débil. Reacciona con oxidantes fuertes, bases o ácidos. Ataca muchos metales en presencia de agua. Ataca los plásticos. La sustancia irrita los ojos, la piel y el tracto respiratorio. La sustancia puede tener efectos sobre el sistema nervioso. La exposición muy por encima del OEL puede producir la muerte. Se recomienda vigilancia médica; El contacto prolongado o repetido con la piel puede producir dermatitis. ALÚMINA: La inhalación de altas concentraciones de polvo de ésta sustancia puede originar irritación de los ojos y tracto respiratorio superior. Barrer la sustancia derramada e introducirla

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en un recipiente, eliminar el residuo con agua abundante, Barrer con cuidado para evitar la formación de polvo. ÁCIDO BENZÓICO: Es posible la explosión del polvo si se encuentra mezclado con el aire en forma pulverulenta o granular; La disolución en agua es un ácido débil. Reacciona con oxidantes. La sustancia se puede absorber por inhalación y por ingestión. No puede indicarse la velocidad a la que se alcanza una concentración nociva en el aire por evaporación de esta sustancia a 20°C. La sustancia irrita los ojos, la piel y el tracto respiratorio.; El contacto prolongado o repetido puede producir sensibilización de la piel. HEXANO: Por evaporación de esta sustancia a 20°C se puede alcanzar bastante rápidamente una concentración nociva en el aire. La sustancia irrita los ojos. La ingestión del líquido puede originar aspiración dentro de los pulmones con riesgo de neumonitis química. La sustancia puede causar efectos en el sistema nervioso central. El contacto prolongado o repetido con la piel puede producir dermatitis. El líquido desengrasa la piel. La sustancia puede afectar al sistema nervioso periférico, dando lugar a polineuropatías. Puede originar lesión genética en los seres humanos. La experimentación animal muestra que esta sustancia posiblemente cause efectos tóxicos en la reproducción humana. CONCLUSIONES: En esta práctica se realizó la separación por columna de una mezcla de azul de metileno con ácido benzóico para obtener fracciones (eluatos) colectadas y después por cromatografía en capa fina compararlas con una muestra testigo para poder identificar los eluatos que contenían ácido benzóico y por destilación simple obtener la muestra deseada que era de ácido benzóico La cromatografía por columna se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias, reteniendo en su fase estacionaria (en este caso la alúmina) a algunos compuestos por su propiedad de adsorción, por la que a través de ella se hará pasar una corriente de disolventes o mezcla de disolventes (fase móvil : eluyente) que arrastrará a los compuestos constituyentes de la mezcla, haciéndoles avanzar a través de la columna. Este tipo de cromatografía se utiliza para saber en que recipientes se encuentra un componente buscado y para determinar la cantidad de este cuantitativamente, contrario a la cromatografía por capa fina donde solo se puede hacer un análisis cuantitativo. BIBLIOGRAFÍA: ° http://depa.pquim.unam.mx(9/oct/2006)

° http://www.fq.uh.cu/dpto/qi/Aimee/sintesis_inor_web/conf_3.htm (28/ago/2006) ° www.ugr.es/~quiored/lab/oper_bas/crom.htm - 22k(Oct/9/2006) ° http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/cromatografias.htm(9/oct/2006)

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