PRACTICA N° 03 INFORME DE LABORATORIO: “FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA”
DOCENTE
:
Lic. Héctor H. Toledo Acosta.
INTEGRANTES
:
Martínez Gil, Fiorella Dámazo Gálvez, Lizbeth Ogura Esteban, Josselyn Medina Quiroz, Mishell Taype Arone, Fortunato Bullón Guzmán, Danny Gonzales Chávez, Frank
E.A.P.
:
INGENIERÍA AMBIENTAL
GRUPO
:
II.
FECHA
:
29 de Abril del 2014.
HUACHO - PERÚ 2014
UNJFSC
INGENIERÍA AMBIENTAL
BIOQUÍMICA
1. RESUMEN En este informe daremos a conocer los resultados de la tercera sesión de laboratorio de Bioquímica, que trata sobre los factores en la actividad de las enzimas. Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteica que aceleran las reacciones que tendrían lugar de manera espontánea sin perderse ni modificarse en su acción, permitiendo las reacciones bioquímicas celulares indispensables para los seres vivos. La actividad enzimática se encuentra determinada por las condiciones tales como la cantidad de enzima, sustrato, la temperatura, el pH, el tiempo de reacción, presencia de cofactores, presencia de moduladores, presencia de inhibidores. En el laboratorio se realizaron 6 experiencias y se dividieron en 5 pruebas, las cuales fueron desarrolladas de forma cualitativa, teniendo en cuenta la concentración del sustrato que es uno de los factores que se aplican sobre la enzima para determinar su actividad. En este caso como sustrato se cuenta con peróxido de hidrogeno que a distintos cambios físicos - químicos nos ayudara a identificar la enzima catalasa que se encuentra en la organela llamada peroxisoma. En dicha organela abunda la enzima. Es importante que conozcamos la estructura y propiedades químicas de los compuestos que se van a utilizar, por lo que es recomendable acudir a notas de clase o a un libro de texto de bioquímica general para un mejor entendimiento y aprovechamiento de la práctica y para presentar y discutir los resultados obtenidos en el cuaderno de prácticas.
2. OBJETIVOS 2.1.
Objetivo General
Demostrar in vitrio la actividad enzimática de los peroxisomas en diferentes células. 2.2.
Objetivos Específicos
Identificar de forma cualitativa las propiedades de las enzimas. Poner en evidencia enzimas mediante su actividad frente a un sustrato de H2O2. Observar si la temperatura y el pH influyen en la actividad enzimática. Realizar un cuadro comparativo de los resultados de las experiencias.
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3. MARCO TEÓRICO
ENZIMAS 3.1. DEFINICIÓN: La Enzima Como Unidad Fundamental De Vida. Cada célula y cada tejido tienen su actividad propia, lo que comporta continuos cambios en su estado bioquímico, en la base de la cual están las enzimas, que tienen el poder de catalizar, facilitar, y agilizar determinados procesos sintéticos y analíticos. Los propios genes son reguladores de la producción de las enzimas; por tanto, genes y enzimas pueden considerados como las unidades fundamentales de la vida.
3.2.
IMPORTANCIA Sin enzimas, no sería posible la vida que conocemos. Igual que la biocatálisis que regula la velocidad a la cual tienen lugar los procesos fisiológicos, las enzimas llevan a cabo funciones definitivas relacionadas con salud y la enfermedad. En tanto que, en la salud todos los procesos fisiológicos ocurren de una manera ordenada y se conserva la homeostasis durante los estados patológicos, esta última puede ser perturbada de manera profunda.
3.3.
ESTRUCTURAS
Las proteínas globulares que presentan las enzimas son muy complejas y grandes, estas se pliegan en sí mismas formando un surco en la que encaja la molécula o las moléculas reactivas denominadas sustrato y donde tiene lugar las reacciones biológicas. Esta región de la enzima es conocida como sitio activo el cual está formado por aminoácidos. El sitio activo no solo tiene una configuración tridimensional complementaria al sustrato, sino también tiene una distribución complementaria de cargas y de zonas hidrofilitas o hidrofóbicas sobre la superficie de unión. De tal modo que el sitio activo no solo reconoce al sustrato sino que lo orienta en una dirección en particular.
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CLASIFICACIÓN 3.4.1.
DE ACUERDO A SU COMPLEJIDAD Se clasifican como:
En las proteínas conjugadas podemos distinguir dos partes: a. APOENZIMA: Es la parte polipeptídica de la enzima. b. COFACTOR: Es la parte no proteica de la enzima. La combinación de la apoenzima y el cofactor forman la holoenzima. Los cofactores pueden ser: Iones metálicos: Favorecen la actividad catalítica general de la enzima, si no están presentes, la enzima no actúa. Estos iones metálicos se denominan activadores. Ejemplos: Fe2+, Mg2+, Cu2+, K+, Na+ y Zn2+. 3.4.2.
SEGÚN SU ACTIVIDAD TIPO DE ENZIMAS
ACTIVIDAD
HIDROLASAS
Catalizan reacciones de hidrólisis. Catalizan las reacciones en las cuales un isómero se transforma en otro, es decir, reacciones de isomerización. Catalizan la unión de moléculas. Catalizan las reacciones de adición de enlaces o eliminación, para producir dobles enlaces. Catalizan reacciones de óxido-reducción. Catalizan la transferencia de un grupo de una sustancia a otra.
ISOMERASAS LIGASAS LIASAS OXIDORREDUCTASAS TANSFERASAS 3.5.
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 3.5.1.
3.5.2.
REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: La actividad metabólica de las células está regulada por la síntesis de productos necesarios para su óptimo funcionamiento; esta regulación depende de la actividad enzimática. Los principales factores que limitan la acción enzimática son las concentraciones de moléculas de enzimas y sustratos, al igual que la disponibilidad de cofactores. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
a. Efecto del pH b. La temperatura c. Interacciones alostéricas
d. Inhibición competitiva e. Inhibición no competitiva f. Inhibición irreversible
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4. MATERIALES 4.1. INSTRUMENTOS Y REACTIVOS DE LABORATORIO 4.1.1. Instrumentos: 1 Cocina eléctrica. 1 Pizeta.
1 Gradilla
1 Mortero porcelana.
2 Vasos de precipitado de 100 y 400 ml.
de 3 Pipetas de 10ml.
1 Cuchillo.
5 Tubos de ensayo.
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INGENIERÍA AMBIENTAL 4.1.2. Reactivos: 24 gta. de HNO3 (en solución conc. al 80%).
6 ml. de ETANOL (ALCOHOL).
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60 gta. de NaOH (en solución conc. al 80%).
30 ml. de H2O2 (en solución conc. al 80%).
4.2. INSUMOS Y MATERIALES ADQUIRIDOS POR LOS ESTUDIANTES 4.2.1. Insumos: 250 gr. de hígado. 3 papas.
5 ramas de apio.
4.2.2.
Materiales: 1 lápiz marcador. 1 cinta masketein.
1 cojín de destilada.
agua
Toallas de papel. Cámara fotográfica.
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5. PROCEDIMIENTO 5.1. Cortar, lavar y cocer las muestras: La papa, el apio y el hígado.
2° Paso Cocer la mitad de las muestras.
4° PASO Esperar que hierva por un periodo de 10 min.
3° PASO Esperar que hierva por un perdiodo de 10 min.
1° PASO Cortar y lavar las muestras: La papa, el apio y el hígado.
5.2. PRUEBA CON EL APIO CRUDO
PASO 1: Machacar el apio crudo.
PASO 2: Picar en pequeños dados el apio.
PASO 3: Introducir el apio en cada uno de los 5 tubos de ensayo.
PASO 4: Enumerar los 5 tubos de ensayo.
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INGENIERÍA AMBIENTAL 5.2.1.
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Tubo 1
PASO 5: Observar y tomar nota.
PASO 4: Llevar el tubo al lavadero y retirar el dedo pulgar.
PASO 3: Cubrir con el dedo pulgar la parte superior del tubo de ensayo y agitar durante 5 min. PASO 2: Adicionar 5 ml. de H2O2 y homogenizar.
PASO 1: Agregar 10 gr de apio machacado a un tubo de ensayo.
5.2.2.
Tubo 2
PASO 5: Observar y tomar nota.
PASO 4: Llevar el tubo al lavadero y retirar el dedo pulgar.
PASO 3: Cubrir con el dedo pulgar la parte superior del tubo de ensayo y agitar durante 5 min.
PASO 2: Adicionar 5 ml. de H2O2 y homogenizar. PASO 1: Agregar 10 gr de apio en trozos en un tubo de ensayo.
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INGENIERÍA AMBIENTAL 5.2.3.
BIOQUÍMICA
Tubo 3
PASO 5: Llevar el tubo al lavadero y retirar el dedo pulgar. Observar y tomar nota.
PASO 4: Cubrir con el dedo pulgar la parte superior del tubo de ensayo y agitar durante 5 min.
PASO 3: Adicionar 5 ml. de H2O2 y homogenizar.
PASO 2: Añadir 4 gotas de HNO3 y agitar. PASO 1: Agregar 10 gr de apio machacado a un tubo de ensayo.
5.2.4.
Tubo 4
PASO 5: Llevar el tubo al lavadero y retirar el dedo pulgar. Observar y tomar nota.
PASO 4: Cubrir con el dedo pulgar la parte superior del tubo de ensayo y agitar durante 5 min.
PASO 3: Adicionar 5 ml. de H2O2 y homogenizar.
PASO 2: Añadir 1 ml.de alcohol y agitar. PASO 1: Agregar 10 gr de apio machacado a un tubo de ensayo.
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INGENIERÍA AMBIENTAL 5.2.5.
BIOQUÍMICA
Tubo 5
PASO 5: Llevar el tubo al lavadero y retirar el dedo pulgar. Observar y tomar nota.
PASO 4: Cubrir con el dedo pulgar la parte superior del tubo de ensayo y agitar durante 5 min.
PASO 3: Añadir 5 ml. de H2O2 y homogenizar.
PASO 2: Añadir 4 gotas de H2SO4 y agitar. PASO 1: Agregar 10 gr de apio machacado a un tubo de ensayo.
5.3. PRUEBA CON LA PAPA CRUDA
PASO 1: Machacar la papa cruda.
PASO 2: Picar en pequeños dados la papa.
PASO 3: Introducir la papa en cada uno de los 5 tubos de ensayo.
PASO 4: Enumerar los 5 tubos de ensayo.
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INGENIERÍA AMBIENTAL 5.3.1.
BIOQUÍMICA
Tubo 1
PASO 5: Observar y tomar nota.
PASO 4: Llevar el tubo al lavadero y retirar el dedo pulgar.
PASO 3: Cubrir con el dedo pulgar la parte superior del tubo de ensayo y agitar durante 5 min. PASO 2: Adicionar 5 ml. de H2O2 y homogenizar.
PASO 1: Agregar 10 gr de papa machacada a un tubo de ensayo.
5.3.2.
Tubo 2
PASO 5: Observar y tomar nota.
PASO 4: Llevar el tubo al lavadero y retirar el dedo pulgar.
PASO 3: Cubrir con el dedo pulgar la parte superior del tubo de ensayo y agitar durante 5 min.
PASO 2: Adicionar 5 ml. de H2O2 y homogenizar. PASO 1: Agregar 10 gr de papa en trozos en un tubo de ensayo.
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INGENIERÍA AMBIENTAL 5.3.3.
BIOQUÍMICA
Tubo 3
PASO 5: Llevar el tubo al lavadero y retirar el dedo pulgar. Observar y tomar nota.
PASO 4: Cubrir con el dedo pulgar la parte superior del tubo de ensayo y agitar durante 5 min.
PASO 3: Adicionar 5 ml. de H2O2 y homogenizar.
PASO 2: Añadir 4 gotas de HNO3 y agitar. PASO 1: Agregar 10 gr de papa machacada a un tubo de ensayo.
5.3.4.
Tubo 4
PASO 5: Llevar el tubo al lavadero y retirar el dedo pulgar. Observar y tomar nota.
PASO 4: Cubrir con el dedo pulgar la parte superior del tubo de ensayo y agitar durante 5 min.
PASO 3: Adicionar 5 ml. de H2O2 y homogenizar.
PASO 2: Añadir 1 ml.de alcohol y agitar. PASO 1: Agregar 10 gr papa machacada a un tubo de ensayo.
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INGENIERÍA AMBIENTAL 5.3.5.
BIOQUÍMICA
Tubo 5
PASO 5: Llevar el tubo al lavadero y retirar el dedo pulgar. Observar y tomar nota.
PASO 4: Cubrir con el dedo pulgar la parte superior del tubo de ensayo y agitar durante 5 min.
PASO 3: Añadir 5 ml. de H2O2 y homogenizar.
PASO 2: Añadir 4 gotas de H2SO4 y agitar. PASO 1: Agregar 10 gr de papa machacada a un tubo de ensayo.
6. RESULTADOS PRIMERA PRUEBA TUBO
PAPA COCIDA
H2O2
OBSERVACIONES
1 2 3 4 5
Machacada. En trozos. Machacada con 4 gts. de HNO3. Machacada con 1 ml de ETANOL. Machacada con 10 gts. de NaOH.
5 ml. 5 ml. 5 ml. 5 ml. 5 ml.
No reacciono. No reacciono No reacciono No reacciono No reacciono
SEGUNDA PRUEBA TUBO 1 2 3 4 5
APIO COCIDO Machacado. En trozos. Machacada con 4 gts. de HNO3. Machacada con 1 ml de ETANOL. Machacada con 10 gts. de NaOH.
H2O2
OBSERVACIONES
5 ml. 5 ml. 5 ml. 5 ml. 5 ml.
No reacciono. No reacciono No reacciono No reacciono No reacciono
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TERCERA PRUEBA TUBO
HÍGADO COCIDO
H2O2
1
Machacado.
5 ml.
2
En trozos.
5 ml.
3
Machacada con 4 gts. de HNO3.
5 ml.
4
Machacada con 1 ml de ETANOL.
5 ml.
5
Machacada con 10 gts. de NaOH.
5 ml.
OBSERVACIONES Menor liberación de gas. Menor liberación de gas. No reacciono. Menor liberación de gas. No reacciono.
CUARTA PRUEBA TUBO
PAPA CRUDA
1
Machacada.
2
En trozos.
3
Machacada con 4 gts. de HNO3.
4
Machacada con 1 ml de ETANOL.
5
Machacada con 10 gts. de NaOH.
H2O2
OBSERVACIONES
5 ml.
Mayor liberación de gas. Media liberación de gas. Ínfima liberación. Menor liberación de gas. Ínfima liberación.
5 ml. 5 ml. 5 ml. 5 ml.
QUINTA PRUEBA TUBO
APIO CRUDO
H2O2
OBSERVACIONES
1
Machacado.
5 ml.
2
En trozos.
5 ml.
3
Machacada con 4 gts. de HNO3.
5 ml.
4
Machacada con 1 ml de ETANOL.
5 ml.
5
Machacada con 10 gts. de NaOH.
5 ml.
Mayor liberación de gas. Menor liberación de gas. Ínfima liberación. Menor liberación de gas. Ínfima liberación.
H2O2
OBSERVACIONES
SEXTA PRUEBA TUBO
HÍGADO CRUDO
1
Machacado.
5 ml.
2
En trozos.
5 ml.
3
Machacada con 4 gts. de HNO3.
5 ml.
4
Machacada con 1 ml de ETANOL.
5 ml.
5
Machacada con 10 gts. de NaOH.
5 ml.
Mayor liberación de gas. Media liberación de gas. Ínfima liberación. Menor liberación de gas Ínfima liberación.
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7. CUESTIONARIO a. ¿Qué son las peroxisomas? Los orgánulos pequeños que participan en la producción y degradación del peróxido de hidrogeno (H2O2), son de formas esférica limitados por una membrana que contiene enzimas oxidativas en particular la CATALASA y otras peroxidasas. ¿Cuál es la estructura de las peroxisomas? El peroxisoma es una organela celular que consta de una membrana, constituida por una doble capa lipídica (de grasas) que contiene diversas proteínas. En su interior se halla una matriz peroxisomal, que contiene proteínas de función enzimática (capaces de transformar unos compuestos en otros). Estas enzimas catalizan muchas reacciones de síntesis y degradación de compuestos de gran importancia metabólica. ¿Cuál es la función? Los peroxisomas tienen múltiples funciones. Destacan las relacionadas con el metabolismo lipídico. Entre ellas se hallan las reacciones de degradación, como la β- oxidación de los ácidos grasos de cadena muy larga (AGCML: de más de 22 átomos de carbono) y del ácido fitánico y también reacciones de formación de plasmalógenos (lípidos complejo s localizados en la mielina), colesterol y ácidos biliares. La β-oxidación peroxisomal de los AGCML acorta la longitud de su cadena para que puedan seguir degradándose en el interior de la mitocondria.
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b. ¿Qué es una enzima y como se relaciona con los peroxisomas? Los peroxisomas se relacionan con las enzimas, por poseer o contener una abundante cantidad de enzima, tales como: Peroxidasa, catalasa, D-aminoácido aminoácido - oxidasa y urato oxidasa. Siendo la principal la enzima catalasa, la cual inmediatamente desdobla el peróxido de hidrogeno (H2O2) en agua y oxigeno evitando que la célula se lesiones. c. ¿Cuáles son los efectos del etanol sobre las enzimas? Ninguno, ya que la enzima catalasa degrada al alcohol. ¿Cuáles son los efectos del ácido nítrico sobre las enzimas? El efecto es desnaturalizarlas, ya que las enzimas poseen un pH característico donde su actividad es máxima: por encima o debajo de ese pH la actividad disminuye. d. Al cocinar los alimentos demasiado: ¿Cómo influye en la actividad de las enzimas? Existen dos factores que alteran o modifican la actividad enzimática: el pH y la temperatura, por ello al ser cocidos los alimentos las enzimas presentes se desnaturalizan por el cambio de temperatura. e. Describe las enzimas presentes en el peroxisoma. Los peroxisomas contienen básicamente tres enzimas oxidantes: D-amino-acid oxidase: Es una enzima peroxisomas que contiene FAD como cofactor que se expresa en una amplia gama de especies de levaduras a humano. No está presente en las plantas o en las bacterias que en su lugar utilizan deshidrogenasa de D-aminoácido. Su función es la de oxidar Daminoácidos a los ácidos aminos correspondientes, la producción de amoniaco y peróxido de hidrógeno. Urato oxidasa: Es una enzima de la clase de las oxidorreductasas, que está presente en varios organismos tanto unicelulares como pluricelulares, notándose sin embargo su ausencia en los seres humanos y en algunos primates, presentándose activa en el catabolismo de las purinas. Catalasa: Es una enzima perteneciente a la categoría de las oxidorreductasas que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno(H202) en oxígeno y agua. De las cuales la catalasa es la que nunca falta. Esta enzima descompone el H2O2 y por lo tanto, es de gran importancia en el metabolismo de los ROS.
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8. RECOMENDACIÓN
Al cocer las muestras evitas que se aplasten. Utilizar ácido nítrico en lugar del ácido clorhídrico. Ser muy cuidadosos al momento de utilizar el HNO3 a las muestras. Sería conveniente realizar otra prueba con las muestras crudas de los tubos 3 y 4, donde se incrementaría 2 gotas más de HNO3 de lo indicado. Se debería realizar una prueba tomando en cuenta la velocidad de la reacción de las enzimas con el sustrato. Se debería realizar una prueba tomando en cuenta el pH que requieren algunas enzimas para realizar su actividad enzimática. 9. CONCLUSIÓN Las peroxisomas posee gran cantidad de enzimas entre ellas la catalasa, la cual degrada a sustancias toxicas como el H2O2 (principal componente del agua oxigenada) convirtiéndolos en H2O y O2. EN LA PRUEBA DE LAS MUESTRAS CRUDAS TUBO N° 1 Y 2: Al comparar los tubos 1 y 2, donde las muestras se encuentran machacadas y en trozos respectivamente. Concluimos que la muestra al ser fragmentada lo más pequeña posible, liberara mayor cantidad de catalasa expidiéndola a que reaccione con el H2O2. Por lo tanto en el los tubos 1 y 2 hubo liberación de gas, formándose H2O y O2. Es redundadle aclarar que en las muestras se encuentran activas las enzimas llamadas catalasas.
TUBO N° 3 La liberación de gas, se dio en menor cantidad. Concluimos que el alcohol no es un factor que influya en la disminución o destrucción de la acción de la enzima llamada catalasa. Sin embargo la pregunta es ¿Por qué la liberación de gas fue en menor cantidad?, la respuesta es sencilla: El alcohol cubre la muestra (papa, apio e hígado) haciendo que la velocidad de actividad enzimática sea menor.
TUBO N° 4 La liberación de gas, se dio en ínfimas cantidades. Concluimos que la enzima llamada catalasa se desnaturalizo en un 98% aproximadamente. La explicación es concreta: El pH fue uno de los factores que desnaturalizan a las enzimas. Por lo tanto se requiere de una mayor cantidad de ácido nítrico para poder desnaturalizar a las enzimas presentes en las muestras.
TUBO N° 5 La liberación de gas, se dio en ínfimas cantidades. Concluimos que los hidróxidos y bases influyeron en la actividad enzimática. La explicación es concreta: Así como el tubo 4, el pH es uno de los factores que desnaturalizan a las enzimas. Por lo tanto se requiere de una mayor cantidad de NaOH para poder desnaturalizar a las enzimas presentes en las muestras.
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EN LA PRUEBA DE LAS MUESTRAS COCIDAS En estas experiencias las conclusiones la realizaremos por tipo de muestra:
MUESTRA DE PAPA: No hubo liberación de gas. Concluimos que la muestra al ser expuesta a altas temperaturas (al ser hervidas), las enzimas presentes se desnaturalizaron. La explicación es sencilla: La temperatura es uno de los factores que desnaturalizan a las enzimas.
MUESTRA DE APIO No hubo liberación de gas. Concluimos que la muestra al ser expuesta a altas temperaturas (al ser hervidas), las enzimas se desnaturalizaron. La explicación es sencilla: La temperatura es uno de los factores que desnaturalizan a las enzimas.
MUESTRA DE HÍGADO En los tubos 1, 2 y 4: La liberación se dio en menor cantidad. Concluimos que la muestra al ser expuesta a altas temperaturas (al ser hervidas), una gran parte de las enzimas se desnaturalizaron y el otro pequeño remanente sobrevivió al calor. Este último realizo la actividad enzimática, liberando gas donde se formaron H2O y O2. En los tubos 2 y 5: No hubo liberación de gas. Concluimos que el pequeño remanente de enzimas que sobrevivió al calor, fueron desnaturalizados por la acción del HNO3 y NaOH. Es redundadle aclarar que el pH fue uno de los factores que desnaturalizan a las enzimas. PREGUNTAS: ¿EN CUÁL DE LOS TUBOS HUBO MAYOR LIBERACIÓN DE GAS? RPTA: La mayor liberación de gas se dio EN EL TUBO 1, ya que no existió ningún componente que influyera en la destrucción y disminución de la actividad enzimática en las muestras. ¿POR QUÉ EN LAS MUESTRAS DE HÍGADO COCIDO NO SE DESTRUYERON LAS ENZIMAS? RPTA: Porque el hígado cuenta con una gran cantidad de enzimas con funciones oxidativas y reductivas. Por ello la muestra al ser hervidas, una gran parte de las enzimas se desnaturalizan y el otro pequeño remanente sobrevive al calor.
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