3.docx

Artikel asli

Dalam Produksi Vivo Antibodi Monoklonal melalui Transfer Gen melalui Elektroporasi Melindungi terhadap Influenza Lethal dan Infeksi Ebola Chasity D. Andrews, 1 , 4 Yang Luo, 1 , 4 Ming Sun, 1 , 3 , 4 Jian Yu, 1 Arthur J. Goff, J. Glass, 2 Neal N. Padte, 1 Yaoxing Huang, 1 , 5 dan David D. Ho 1 , 5 1 Pusat Penelitian Aaron Diamond AIDS, Universitas Rockefeller, New York, NY 10016, AS; Menular, Frederick, MD 21702, USA

2

2

Pamela

US Army Medical Research Institute of Penyakit

Antibodi monoklonal (mAbs) memiliki kegunaan klinis yang luas, tetapi akses global dibatasi oleh biaya tinggi dan ketidakpraktisan yang dikaitkan dengan pemberian pasif yang berulang. Di sini, kami menggambarkan teknologi platform transfer gen DNA berbasis elektroporasi yang dioptimalkan yang dapat digunakan untuk produksi mAbs fungsional in vivo, dengan potensi untuk mengurangi biaya dan beban administrasi. Kami menunjukkan bahwa beberapa mAbs dapat secara bersamaan diekspresikan pada konsentrasi protektif untuk jangka waktu yang panjang menggunakan dosis DNA dan kondisi elektroporasi yang layak secara klinis. MAbs menyatakan juga bisa melindungi tikus terhadap mematikan influenza atau tantangan virus Ebola. Temuan kami menunjukkan bahwa DNA transfer gen platform teknologi ini bisa menjadi muka yang mengubah permainan yang memperluas akses ke terapi mAb efektif secara global.

PENGANTAR Antibodi monoklonal (mAbs) adalah salah satu kelas terapi yang paling cepat berkembang yang dikembangkan untuk berbagai indikasi termasuk kanker, gangguan fl ammatory, dan penyakit menular. 1 Banyak terapi mAb seperti trastuzumab (Herceptin) biaya sebanyak $ 100.000 per tahun per pasien, 2 mengakibatkan berkurangnya akses di banyak pasar global. Karena biaya tinggi yang melekat terkait dengan fasilitas dan proses manufaktur antibodi, biosimilars hanya akan sedikit menurunkan biaya terapi mAb. Selain itu, kondisi penyimpanan mAb dan administrasi berulang tidak praktis untuk banyak negara berkembang. Oleh karena itu terobosan teknologi utama diperlukan untuk membuat terapi mAb tersedia dan terjangkau secara global. Salah satu pendekatan transformatif potensial terhadap terapi antibodi adalah untuk memproduksi mAb pada pasien. Gen-gen yang mengkode mAb dapat dimasukkan ke dalam sel-sel inang tertentu (misalnya, otot), yang kemudian berfungsi sebagai " pabrik " untuk produksi antibodi in vivo. Secara konseptual, strategi transfer gen seperti itu telah ditunjukkan pada model hewan menggunakan vektor virus seperti virus terkait-adeno (AAV) yang memberikan perlindungan anti-tubuh terhadap virus pernapasan syncytial (RSV), 3 simian immunode fi ciency virus (SIV), 4 HIV tipe 1 (HIV-1), 5 dan fl uenza

virus. 6 - 8 The dekat keabadian produksi antibodi vivo pada ditimbulkan oleh pengiriman vektor AAV sistemik menjadikan pendekatan ini lebih mirip dengan vaksinasi. Meskipun pengiriman AAV intranasal menawarkan potensi untuk mengurangi durasi ekspresi, 6 persistensi berkepanjangan dari produksi mAb tingkat tinggi dengan pengiriman AAV sistemik menimbulkan kekhawatiran konsekuensi buruk yang mungkin terwujud hanya beberapa bulan atau tahun kemudian, dan ini tetap menjadi masalah utama. rintangan regu-latory untuk transfer gen antibodi AAV yang diperantarai sistemik. Pendekatan lain untuk transfer gen antibodi adalah dengan memanfaatkan DNA plasmid (pDNA). Sejumlah besar kandidat vaksin menggunakan pDNA untuk mengekspresikan antigen in vivo. pDNA telah diuji untuk produksi mAb karena pDNA mudah untuk memproduksi, tidak memiliki persyaratan penyimpanan rantai dingin, dan memiliki keselamatan klinis yang menguntungkan pro fi le to date. 9 Transduksi transduksi dan ekspresi biasanya rendah setelah injeksi intramuskular (im), kecuali elektro-kultur vivo diterapkan secara konkuren. Fungsi EP melalui penerapan pulsa listrik yang menghasilkan destabilisasi membran sel dan DNA elektroforesis memfasilitasi pengiriman DNA ke dalam sel. 10 Diduga, mAbs diekspresikan secara endogen oleh sel otot yang ditransduksi dan dilepaskan ke sirkulasi. Penelitian sebelumnya pada pDNA / EP untuk transfer gen antibodi telah menunjukkan bahwa mAb yang diproduksi in vivo secara fungsional utuh dan dapat melindungi tikus dari fl uenza, 11,12 Dengue, 13 atau tantangan virus Chikungunya. 14 Meskipun beberapa studi ini menunjukkan persistensi produksi antibodi in vivo yang cukup selama berminggu-minggu sampai berbulanbulan, 11 - 14 lainnya tidak. 15 - 17 Yang penting, upaya pDNA / EP sebelumnya biasanya menghasilkan konsentrasi antibodi serum / plasma yang rendah (<1 m g / mL) 13 - 16 saat menggunakan dosis pDNA (25 - 300 m g) untuk antibodi tunggal 11 - 17 yang terlalu tinggi untuk meningkatkan penggunaan manusia.

Diterima 11 Juli 2017; diterima 13 September 2017; https://doi.org/10.1016/j.omtm.2017.09.003 . 3

Hadir alamat: Institut Biologi Kedokteran, Cina Akademi Ilmu Kedokteran dan Peking Union Medical College, Kunming, Yunnan, Republik Rakyat Cina

4

Para penulis ini memberikan kontribusi yang sama untuk pekerjaan ini.

5

Penulis ini memberikan kontribusi yang sama untuk pekerjaan ini.

Korespondensi: David D. Ho, Pusat Penelitian Aaron Diamond AIDS, Universitas Rockefeller, New York, NY 10016, AS. E-mail: [email protected]

74

Terapi Molekuler: Metode & Pengembangan Klinis Vol. 7 Desember 2017 ª 2017 American Society of Gene dan Terapi Sel. Ini adalah artikel akses terbuka di bawah lisensi CC BY ( http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ).

www.moleculartherapy.org

SEBUAH

Gambar 1. Dioptimalkan Gen Cassettes dan Vektor Meningkatkan Tulang Belakang Dalam Ekspresi Vivo mAb (A) Perbandingan ekspresi 5A8 mAb dari waktu ke waktu dengan konfigurasi gen pDNA (50 m g) yang berbeda di pVAX1 vektor yang dikelola oleh EP pada tikus BALB / c (n = 5 –8).

B

Konsentrasi serum 5A8 diukur dengan CD4 mengikat ELISA. (B) vektor ekspresi gWiz menghasilkan lebih tinggi konsentrasi mAb dari pVAX1. Mengikuti 20 U dari pretreatment aluronidase, BALB / c mencit (n = 3) diberikan 10 m g dari pVAX1 (garis padat) atau gWiz (putus-putus baris) encoding H / L dari C179 atau S139 / 1. Serum mAb konsentrasi diukur dengan pengikatan spesifik HA ELISA. Data disajikan sebagai mean ± SEM. H / L, plasmid terpisah membawa gen rantai H dan L di bawah

Promotor CMV; HL, plasmid tunggal dengan gen rantai H dan L di bawah CMV dan elongasi faktor-1 alpha (hEF1 a ) promotor, masing-masing; LH, satu plasmid dengan gen rantai L dan H di bawah CMV dan hEF1 sebagai promotor, masing-masing; 2A, plasmid tunggal dengan gen H-dan L-rantai di bawah promotor CMV dipisahkan oleh situs pembelahan furin digabungkan dengan peptida pengolahan mandiri P2A; IA, imunoadhesin.

Di sini, kami menjelaskan evaluasi sistematis pDNA / EP untuk menempatkan teknologi platform ini untuk menghasilkan mAbs in vivo pada jalur untuk pengembangan klinis. Menggunakan parameter eksperimental yang dapat diterapkan secara klinis, termasuk kondisi EP yang dapat diterima pada manusia dan dosis DNA yang layak secara klinis, kita sekarang dapat mencapai konsentrasi mAb pada tikus yang berada dalam rentang terapeutik selama beberapa bulan. Selain itu, kami menggunakan teknologi ini untuk mantan pers beberapa mAbs in vivo secara bersamaan dan menunjukkan mereka pelindung efficacy terhadap influenza dan virus Ebola, dua dari biothreats terbesar saat ini.

HASIL Gene Cassette, Regimen, dan Pengoptimalan Vektor Meningkatkan Ekspresi mAb

EP sebelumnya terbukti meningkatkan ekspresi transgen dari pDNA yang dikirim.

15,16

Kami mengoptimalkan kaset transfer gen ke mini-

mize jumlah pDNA disuntikkan diperlukan untuk mendapatkan ekspresi mAb tinggi. Di sini, lima gen gurations kaset con fi memanfaatkan vektor pVAX1 (Invitrogen Thermo Fisher Ilmiah fi c, Grand Island,

NY) dievaluasi dengan 5A8, prekursor tikus mAb dari HIV-1 entry inhibitor ibalizumab (iMab)

18,19

sebagai antibodi model

( Gambar S1 A). Co-injeksi plasmid yang terpisah membawa berat(H) dan gen (L) -chain rantai (H / L) di bawah kendali promotor cytomegalovirus (CMV) dibandingkan dengan injeksi tunggal plasmid dual-pro-moter yang mengandung gen H-dan L-chain, serta plasmid promotor tunggal. konstruk dengan gen H-dan L-chain dipisahkan oleh situs pembelahan furin digabungkan dengan peptida pengolahan mandiri P2A (2A) tunggal (scFv) menyatu dengan

13,20

atau fragmen variabel rantai

wilayah Fc yang dikenal sebagai immunoadhesin (IA) ( Gambar S1 A). 4,6 Semua kaset ekspresi gen menghasilkan mAb atau molekul mirip MAb in vitro ( Gambar S1 B) dengan aktivitas pengikatan dan fungsional yang kompatibel dengan pasokan klinis iMab sebagaimana dinilai oleh ELISA dan netralisasi HIV-1, masing-masing ( Gambar S1 C). ). Ketika dibandingkan setelah injeksi im dengan EP pada tikus, co-injeksi dari dua plasmid gen cas-settes (H / L) pada rasio 1: 1 menghasilkan konsentrasi serum mAb tertinggi ( Gambar 1 A) ketika dinormalisasi oleh jumlah pDNA disuntikkan. Serum 5A8 mAb diproduksi oleh transfer gen in vivo dengan kaset gen plasmid H / L fungsional seperti yang ditunjukkan oleh

ex vivo netralisasi HIV-1 pseudotyped virus ( Gambar S2 A), dan ekspresi mAb tergantung dosis diamati dengan pDNA diberikan melalui EP ( Gambar S2 B). Jumlah pDNA yang digunakan untuk menghasilkan tingkat ekspresi mAb fungsional mungkin terlalu tinggi untuk diterjemahkan ke aplikasi klinis. Untuk meningkatkan ekspresi transgen, pra-perlakuan dengan hyaluron-idase ditambahkan ke rejimen. Hyaluronidase rusak hyaluronan, komponen matriks ekstraseluler otot skeletal, untuk memfasilitasi difusi DNA. hingga 2,9 kali lipat ekspresi mAb yang lebih tinggi diamati

11,21,22

Konsisten dengan re-port sebelumnya, 11,12,21,23

2,7-

berikut pretreatment hyaluronidase ( Gambar S3 ). Selanjutnya, kami membandingkan ekspresi mAb dengan dua vektor vaksin DNA yang tersedia secara komersial, pVAX1 dan gWiz (Aldevron, Fargo, ND, USA). Sedangkan pVAX1 (3.0 kb) adalah vektor dasar kecil, gWiz (5.1 kb) lebih besar dengan penambahan intron hulu ke transgen dan orientasi elemen / komposisi komposisi bakteri yang luas. 24 The H dan L-rantai gen dari dua mAbs anti-influenza, C179 25 dan S139 / 1, 26 diklon ke pVAX1 dan gWiz. Tikus admin-istered 10 m g H / L pDNA dari mAb individu diikuti oleh EP. Pada hari ke 21, konsentrasi S139 / 1 dan C179 masing-masing 2,6 dan 3,0 kali lipat lebih tinggi, ketika vektor gWiz digunakan dibandingkan dengan vektor pVAX1 ( Gambar 1 B). Oleh karena itu, gWiz digunakan sebagai vektor expres-sion untuk semua studi selanjutnya. Tanggapan mba Oligoklonal yang Diinduksi oleh pDNA / EP Melindungi Tikus dari Influenza Infeksi

Kami akhirnya bertujuan untuk menguji profilaksis efficacy dari pDNA / EP mAb pendekatan transfer gen in vivo menggunakan model tantangan influenza. Untuk memahami dampak dari individu versus antibodi kombinasi untuk pencegahan influenza fl, kita pertamatama dievaluasi dua mAbs H3-reaktif, S139 / 1 dan 9H10, untuk perlindungan terhadap influenza A / Prefektur / 2/68 (H3N2) tantangan. Mouse anti-in fl uenza mAbs digunakan untuk memungkinkan studi jangka panjang pada tikus tanpa komplikasi respon anti-mAb lintas spesies. Semua mAbs dibangun uti-lizing imunoglobulin G2a (IgG2a), yang istimewa berinteraksi dengan reseptor Fc untuk IgG (Fc g Rs), 27 persyaratan untuk in vivo protec-tion terhadap influenza dengan luas menetralisir anti-influenza

Terapi Molekuler: Metode & Pengembangan Klinis Vol. 7 Desember 2017 75

Terapi Molekuler: Metode & Pengembangan Klinis

Gambar 2. Dioptimalkan Regimen pDNA / EP Menghasilkan Respon mba Oligoklonal yang Tahan Lama pada Tikus

BALB / c tikus (n = 8) yang pra-perawatan dengan 20 U dari hialuronidase dan diberikan 10 m g H / L gWiz pDNA encoding setiap C179, S139 / 1, dan 9H10 di situs yang berbeda diikuti oleh EP. Konsentrasi serum mAb diukur dengan ELISAs pengikatan spesifik HA. Semua data disajikan sebagai mean ± SEM.

mAbs. 27,28 Tikus pasif diresapi dengan 100 m g (5 mg / kg) baik individu mAb 1 hari sebelum menantang benar-benar dilindungi dari di fl terkait influenza kematian. Meskipun 10 m g individu mAb (0,5 mg / kg) mengakibatkan signifikan di fl terkait influenza morbiditas dan mortalitas, co-penyelenggara S139 / 1 dan 9H10 di 10 m g / mAb meningkatkan kapasitas pelindung dari mAbs mengakibatkan perlindungan lengkap dari di fl mortalitas terkait influenza, mendukung mengeva-tion dari respon mAb oligoclonal sebagai influenza imunoprofilaksis ( Gambar S4 ). Untuk menentukan apakah teknologi transfer gen kami dapat mengekspresikan banyak mAbs secara bersamaan, kami memberikan 10 m g H / L pDNA di pengulangan backbone gWiz untuk masing-masing dari tiga anti-in fl u-enza mAbs - C179, grup 1 hemagglutinin-stalk- mengikat mAb, 25 S139 / 1, sebuah kelompok reaktif yang luas 1 dan 2 mAb mengikat kepala, 26 dan 9H10, kelompok 2 hemagglutinin-tangkai mengikat mAb 29 - untuk tikus di situs yang berbeda diikuti oleh EP. The mAbs dipilih sedemikian rupa sehingga dua mAbs yang reaktif terhadap kedua virus H1 (C179 dan S139 / 1) virus dan H3 (S139 / 1 dan 9H10), di fl subtipe influenza terutama respon-jawab untuk musiman pada infeksi influenza, sementara menargetkan dua situs rentan berbeda pada setiap virus. Ketiga mAbs diekspresikan secara lama dengan konsentrasi mAb serum puncak (3,5 - 4,9 m g / mL) yang dicapai antara minggu 4 dan 8 dengan konsentrasi menurun secara bertahap menjadi 0,5 - 0,7 m g / mL pada minggu ke 43 ( Gambar 2 ).

Berikutnya, kami mengevaluasi pelindung efficacy dari anti-influenza respon mAb oligoclonal dihasilkan oleh pDNA / EP transfer gen terhadap kelompok 1 dan 2 di tantangan influenza fl. BALB / c tikus disuntikkan im di anggota badan yang terpisah dengan 10 m g H / L pDNA di tulang punggung gWiz pengkodean setiap C179, S139 / 1, dan 9H10 diikuti oleh EP. Sebagai kontrol, BALB / c tikus disuntik dengan 10 m g H / L pDNA encoding masing-masing tiga mAbs anti-Ebola murine (2G4, 4G7, dan 13C6) diikuti oleh EP. Ekspresi individu anti-influenza mAbs itu con fi rmed pada hari-hari

12 dan 19 setelah transfer gen, dengan konsentrasi serum rata-rata 2,0 - 6,2 m g / mL per mAb ( Angka S5 A dan S5C) dibandingkan dengan konsentrasi total rata-rata anti-Ebola mAb dari 10,4 - 17,4 m g / mL ( Gambar- ures S5 B dan S5D). Tikus ditantang dengan 39 MLD 50 (median Dosis mematikan) dari A / WSN / 33 (H1N1) 23 hari setelah transfer gen mAb. Berat badan pada hewan kontrol adalah awal yang cukup besar pada hari 2, sedangkan penurunan berat badan pada tikus mengungkapkan anti-influenza mAbs kurang menonjol ( Gambar 3 A). Yang penting, 9 dari 10 tikus mengungkapkan mAbs anti-influenza selamat tantangan dibandingkan dengan 0 dari 8 tikus mengungkapkan anti-Ebola mAbs (p <0,0001, log rank test; angka yang cukup ure 3 A). Untuk menguji luasnya strategi transfer gen ini, satu set tikus yang diobati dengan pDNA / EP ditantang seperti yang dijelaskan di atas dengan 21 MLD 50 dari A / Aichi / 2/68 (H3N2). Tujuh dari 10 tikus selamat tantangan, meskipun tikus mengungkapkan anti-influenza mAbs awalnya menjadi sakit seperti yang ditunjukkan oleh penurunan berat badan ( Gambar 3 B). Sebagai perbandingan, tikus Ebola mAb-mengekspresikan sakit dengan kecepatan yang lebih besar dan penurunan berat badan yang ditandai, sehingga protokol diamanatkan manusiawi pengorbanan 4 - 6 hari setelah tantangan (p <0,0001, log rank test; Gambar 3 B). Hasil ini menunjukkan bahwa oligoclo-nal anti-in fl uenza respon mAb yang dihasilkan in vivo oleh transfer gen dapat melindungi dari kedua kelompok 1 (H1N1) dan 2 (H3N2) pada fl uenza A strain. Untuk menyelidiki apakah hewan mengembangkan heterozubtic immu-nity, kami menantang tikus yang masih hidup dari Gambar 3 dengan virus hetero-subtypic 27,5 minggu setelah transfer gen dari anti-in fl uenza mAb cocktail. Berdasarkan data farmakokinetik dari penelitian serupa ( Gambar 2 ), konsentrasi serum mAb yang diungkapkan oleh pDNA / EP diharapkan menjadi rendah (0,7-1,5 m g / mL) tapi signifikan pada saat tantangan heterosubtypic. Tujuh tikus yang dilindungi dari A / Aichi / 2/68 (H3N2) kemudian ditantang dengan A / WSN / 33 (H1N1; Gambar 4 A), sedangkan sembilan tikus yang dilindungi dari A / WSN / 33 (H1N1) kemudian ditantang dengan A / Aichi / 2/68 (H3N2) ( Gambar 4 B). Dalam kedua kasus, 100% dari tikus yang dilawan sebelumnya dilindungi dari tantangan heterosubtypic, dengan penurunan berat badan min-imal dan tidak ada kematian yang diamati dibandingkan dengan tikus kontrol, yang semuanya mengalami infeksi ( Gambar 4 ). Bahkan, perlindungan terhadap kematian lebih lengkap dalam tantangan kedua. Hasil ini menunjukkan bahwa imunoprofilaksis oligoclonal disediakan oleh pDNA / EP tidak hanya melindungi tikus dari tantangan virus ( Gambar 3 ), tetapi juga kemungkinan besar memungkinkan generasi dari respon imun host ke heterolog influenza regangan ( Gambar 4 ). Respons Oligoclonal mAb Melindungi Tikus dari Infeksi Virus Ebola

Untuk menyelidiki kekokohan platform pengiriman gen ini, kami selanjutnya menerapkan pDNA / EP untuk pencegahan penyakit menular yang berbeda di mana perlindungan yang berhasil telah diberikan oleh respon mAb oligoklonal. Epidemi virus Ebola tahun 2014 di Afrika Barat dan kemungkinan wabah di masa mendatang menyoroti kebutuhan kritis untuk profilaksis dan pengobatan yang cepat dan efektif. ZMapp, cocktail mAb yang terdiri dari 13C6, 2G4, dan 4G7, saat ini adalah satu-satunya koktail mAb anti-Ebola yang digunakan pada manusia, 30 dan itu diberikan perlindungan lengkap pada kera saat diberikan sebagai pasca-paparan

76

Terapi Molekuler: Metode & Pengembangan Klinis Vol. 7 Desember 2017

www.moleculartherapy.org

Gambar 3. Respon mAb Oligoclonal Melindungi Tikus

SEBUAH dari Kelompok 1 atau Kelompok 2 Tantangan Influenza

BALB / c mencit (n = 20) yang pra-perawatan dengan 20 U dari hialuronidase dan diberikan 10 m g H / L gWiz pDNA per anti-influenza mAb (C179, S139 / 1, dan 9H10) di otot anggota badan yang terpisah diikuti oleh EP. Untuk kontrol kelompok, BALB / c tikus (n = 15) yang praperawatan dengan 20 U dari hialuronidase dan diberikan 10 m g H / L gWiz pDNA per anti-Ebola mAb (2G4, 4G7, dan 13C6) di situs yang berbeda dengan EP. Darah dikumpulkan pada hari ke 12, 19, dan 33 (pada tikus yang bertahan hidup) untuk analisis farmakokinetik ( Gambarure S5 ) . (A dan B) Pada hari ke 23, tikus diacak dan tikus anti-influenza DNA / EP (n = 10) dan anti-Ebola DNA / EP tikus (n = 7 - 8 ) ditantang dengan (A) 39 MLD 50 dari A / WSN / 33 (H1N1) atau (B) 21 MLD 50 dari A / Aichi / 2 /

B 68 (H3N2) dikirim secara intranasal. (A dan B) Berarti berat badan

loss (%) ± SEM dibandingkan dengan hari 0 (kiri) dan survival (%) seperti yang digambarkan dalam plot KaplanMeier (kanan) berikut (A) Tantangan H1N1 dan (B) H3N2. Untuk penurunan berat badan persen grafik, ** p = 0,0021, *** p <0,0001.

profilaksis dalam 5 hari tantangan. 31 komponen ZMapp telah diuji secara individual atau dalam kombinasi lain sebagai profilaksis pada tikus dengan transfer pasif, 32,33 sedangkan kombinasi ZMapp memberikan perlindungan saat dikirim sebagai profilaksis oleh AAV. 34 Di sini, kami mengevaluasi profilaksis efficacy dari ZMapp ketika deliv-ered oleh pDNA / EP.

Untuk menghindari imunogenisitas lintas spesies, kami membangun antibodi ZMapp dengan murine IgG2a Fc (mZMapp). Pemberian mZMapp secara pasif pada dosis rendah (10 m g / mAb; 30 m g) atau tinggi (40 m g / mAb; 120 m g total) dosis menghasilkan konsentrasi serum mZMapp rata-rata 1 hari setelah penyuntikan 21,2 dan 66,4 m g / mL , masing-masing, dan waktu paruh normal 6,2 - 7,2 hari ( Gambar S6 A). Dalam percobaan lanjutan, tikus diinfus secara pasif dengan dosis mZMapp yang sama dan chal-lenged dengan 100 unit pembentuk plak (PFUs) virus Ebola yang diadaptasi oleh tikus (strain 1976, Mayinga 35 ) 1 hari setelah pemberian mAb. Tinggi pelindung efficacy (17/20 tikus; 85%) diamati pada tikus yang diberikan 120 m g mZMapp (6 mg / kg Total mAb; Gambar S6 B). Namun, tidak ada perbedaan yang signifikan yang diamati antara tikus menerima 30 m g mZMapp (1,5 mg / kg Total mAb) dan kontrol tikus diberikan 30 m g S139 / 1, anti-influenza mAb menjabat sebagai kontrol ( Gambar S6 B). Kami kemudian mengevaluasi berbagai dosis pDNA (5 - 50 m g) yang mengkodekan H / L masing-masing dari tiga mA mappim dalam vektor gWiz dalam percobaan transfer gen. Kadar mzMapp serum umumnya bergantung pada dosis pDNA, dengan tingkat tertinggi atau terendah yang diamati pada kelompok yang disuntik dengan 50 atau 5 m g pDNA / mZMapp mAb, masing-masing. Perbedaan minimal diamati antara kelompok tikus yang di-jected dengan 10 atau 25 m g pDNA / mZMapp mAb ( Gambar 5 A). Serupa

Kecenderungan diamati 14 hari setelah pemberian pDNA / EP ( Gambar 5 B). Tikus (n = 20 per kelompok) diberikan 5, 10, 25, atau 50 m g pDNA untuk masing-masing tiga mZMapp mAbs untuk mengevaluasi pelindung efficacy ini rejimen pDNA / EP. Sebagai kontrol, tikus (n = 30) diberikan 150 m g pDNA encoding H / L dari anti-influenza mAb, S139 / 1. Darah dikumpulkan 14 hari setelah pemberian pDNA / EP, dan berarti total serum konsentrasi mZMapp 8,2, 10,7, 13,6, dan 35,6 m g / mL, masing-masing ( Gambar 5 B). Tikus kemudian ditantang 28 atau 31 hari setelah pemberian pDNA / EP dengan 100 PFU dari virus Ebola yang diadaptasi oleh tikus (strain 1976, Mayinga 35 ). Perlindungan lengkap dari kematian diamati pada tikus yang diberikan 10 atau 50 m g pDNA / mZMapp mAb ( Gambar 5 C). Satu tikus admin-istered 25 m g pDNA / mZMapp mAb menyerah penyakit pada hari ke 7 setelah tantangan, menghasilkan 95% (19/20 tikus) perlindungan. Dengan dosis 5 m g pDNA / mZMapp mAb, 70% (14/20 tikus) perlindungan tercatat. Sebaliknya, semua 30 tikus kontrol menyerah pada infeksi 3 - 8 hari setelah tantangan ( Gambar 5 C). Menariknya, semua tikus di 5 m g kelompok pDNA ditampilkan tanda-tanda infeksi 4 hari setelah tantangan ( Gambar 5 D). Sebagai perbandingan, 7 dari 20 tikus di 10 m g kelompok pDNA menunjukkan tanda-tanda sakit pada hari 7 - 8, sedangkan hanya 3 dari 20 tikus di 25 m g pDNA kelompok menunjukkan tanda-tanda penyakit ( Gambar 5 D). Berdasarkan data farmakokinetik sebelumnya ( Gambar 5A), konsentrasi serum mzMapp total rata-rata pada minggu ke-5, mendekati waktu chal-lenge, diharapkan menjadi 8.8, 11.5, 13.4, dan 29.4 m g / mL untuk 5, 10 , 25, dan 50 m kelompok g pDNA, masing-masing, menunjukkan corre-lation antara jumlah serum konsentrasi mZMapp dan protec-tive efficacy. Ekspresi antibodi berkelanjutan selama minimal 15 minggu dengan paruh 9,5-12,2 minggu (66-85 hari) diamati pada tikus yang diberikan 10 atau 50 m g pDNA / mZMapp mAb sebelum penurunan lambat dalam ekspresi ( Gambar S7 ) ; Oleh karena itu, diharapkan durasi protektif yang disediakan oleh administrasi pDNA / EP mungkin setidaknya 2 - 3 bulan.

Terapi Molekuler: Metode & Pengembangan Klinis Vol. 7 Desember 2017 77

Terapi Molekuler: Metode & Pengembangan Klinis

SEBUAH

Gambar 4. Imunitas Heterosubtypic Melindungi Tikus dari Influenza Challenge

(A dan B) BALB / c tikus bertahan A / Aichi / 2/68 chaltantangan lenge (n = 7) atau A / WSN / 33 (n = 9) (dari Gambar 3 ) kemudian ditantang secara intranasal 27,5 minggu setelah tantangan awal dengan (A) 39 LD 50 A / WSN / 33 (H1N1) atau (B) 21 LD 50 dari A / Aichi / 2/68 (H3N2), masing-masing tively. Tikus kontrol adalah 12 minggu pada saat tantangan. (Kiri) Berarti penurunan berat badan (%) ± SEM dibandingkan dengan hari 0 dan (kanan) kelangsungan hidup (%) seperti yang digambarkan di KaplanMeier plot berikut tantangannya. badan persen

Untuk penurunan berat

grafik, ** p = 0,0016, *** p % 0,0001.

B

DISKUSI

Biaya saat ini terkait dengan terapi mAb, kepraktisan administrasi infus pasif, dan kebutuhan dosis berulang melarang ketersediaan global. Kami telah bertujuan untuk mengejar produksi mAb in vivo melalui teknologi transfer gen yang bisa menjadi lebih murah dan lebih mudah, sehingga memperluas akses ke obat-obatan antibodi di daerah-daerah di luar negara-negara kaya. Di sini, kami melaporkan hasil percobaan transfer gen kami menggunakan pDNA yang disampaikan oleh EP untuk menghasilkan beberapa mAbs fungsional pada tikus. Kami percaya bahwa penelitian mendalam kami telah memindahkan pDNA / EP di luar laporan awal, menempatkan teknologi platform ini pada landasan yang kuat untuk pengembangan klinis. Untuk percobaan fi keampuhan ef kami pada tikus, kami menggunakan dosis pDNA (5 - 10 m g) yang terukur bagi manusia, berbeda dengan penelitian sebelumnya (25-300 m g). 11 - 17 Meskipun inokulum yang lebih rendah dari pDNA, kami mengamati lebih tinggi ekspresi mAb dengan mean puncak serum Concentra-tions (3 - 5 m g / mL) ( Gambar 2 ) yang 3 sampai 10 kali lipat lebih tinggi dari temuan sebelumnya. 13 - 17 Selanjutnya, konsentrasi mAb tetap 1 m g / mL hingga 32 minggu ( Gambar 2 ), yang lebih persisten yang dijelaskan sebelumnya, 14,16,17 karena itu berpotensi memperpanjang jendela terapeutik untuk pengobatan dan pencegahan. Yang diamati konsentrasi serum antibodi jatuh baik dalam rentang terapeutik untuk banyak mAbs dalam penggunaan klinis saat ini, 1,36 dan durasi antibodi ekspresi menjadi pertanda baik untuk administrasi pDNA / EP yang jarang. Perlu dicatat bahwa dalam penelitian kami, hewan ditantang 3 - 4 minggu setelah pemberian DNA / EP, menyiratkan daya tahan perlindungan dan berpotensi berdampak pada pencegahan penyakit di daerah berkembang. Kami menunjukkan bahwa platform transfer gen pDNA / EP kami dapat menghasilkan mAbs fungsional in vivo terhadap patogen virus yang merupakan salah satu biothreats terbesar bagi umat manusia saat ini. Secara khusus, yang mAbs menyatakan diberikan perlindungan solid melawan tantangan parenteral dengan

dalam virus influenza fl (kelompok 1 dan 2) atau strain dari virus Ebola. Kami mencatat bahwa kami mencapai protec-tion menggunakan lemah menetralkan pertama mAbs generasi. Banyak mAb yang lebih kuat diarahkan terhadap fl uenza dan virus Ebola

dikembangkan, 37-44 dan cacies fi ef pelindung mereka diharapkan menjadi lebih unggul bila disampaikan oleh pDNA / EP. Kami juga mencatat bahwa penelitian kami saat ini menunjukkan secara bersamaan ekspresi beberapa mAbs in vivo, yang mungkin penting dalam perlindungan yang mampu karena memiliki potensi memberikan aktivitas dan / atau keluasan yang lebih besar. Beberapa pendekatan transfer gen sedang dikejar untuk mengekspresikan mA terapeutik in vivo. Pengiriman AAV dari gen mAb ke otot dapat menghasilkan ekspresi antibodi yang tinggi yang berlangsung selama bertahun-tahun. 4,45 Namun, dekat permanen ekspresi antibodi menimbulkan fi kan kekhawatiran peraturan signifikan yang harus diatasi, kecuali yang efektif “off” bisa direkayasa. Pengiriman RNA pengkodean gen juga dapat menghasilkan produksi protein atau mAb in vivo. 46 konsentrasi serum Terapi dapat dicapai akut, tetapi translasi paruh biasanya di urutan jam untuk sehari, 47 menghasilkan farmakokinetik pro fi le mirip dengan infus pasif dari protein terapeutik atau mAb di terbaik. 46 Membandingkan dan kontras transfer gen ini pendekatan dengan temuan kami menggunakan pDNA / EP, saat ini “sweet spot” dari penggunaan klinis potensial tampaknya tahun untuk AAV, bulan untuk DNA, dan hari untuk strategi pengiriman RNA. Durasi ekspresi antibodi beberapa bulan dapat ideal untuk situasi seperti wabah musiman ketika ekspresi permanen tidak diperlukan, memberikan jendela terapeutik yang memadai untuk berdampak ketika akses pencegahan global terbatas. Addi-tionally, pengembangan kekebalan heterosubtypic selama ekspresi antitubuh memiliki implikasi yang luas untuk perlindungan terhadap beragam di strain influenza fl. Perangkat EP kita dimanfaatkan di sini (nanah 's TriGrid Delivery System 48), bersama dengan parameter medan listrik, tidak hanya mendorong immu-nogenicity vaksin DNA, tetapi juga menunjukkan dapat diterima keamanan, ketahanan, dan penerimaan pro fi le pada manusia. 49 Satu tantangan yang kita hadapi dalam memindahkan teknologi pDNA / EP ini ke dalam penggunaan manusia

78

Terapi Molekuler: Metode & Pengembangan Klinis Vol. 7 Desember 2017

www.moleculartherapy.org

SEBUAH

Gambar 5. mZMapp Disampaikan oleh pDNA / EP Protects

B

Tikus dari Lethal Ebola Virus Challenge (A) BALB / c mencit (n = 6 - 9 ) diberi perlakuan awal dengan 20 U dari hialuronidase dan diberikan 5, 10, 25, atau 50 m gH/L gWiz pDNA encoding setiap 2G4, 4G7, dan 13C6 di otot anggota badan yang terpisah diikuti oleh EP. Total serum konsentrasi mZMapp diukur dengan pengikatan GP ELISA. Semua data disajikan sebagai mean ± SEM. (B –D) BALB / c mencit (n = 20 / kelompok) yang pra-perawatan dengan 20 U dari

hialuronidase dan diberikan 5, 10, 25, atau 50 m g H / L gWiz pDNA per Ebola mAb yang terdiri dari mZMapp

cocktail (2G4, 4G7, dan 13C6) atau 150 m g H / L gWiz pDNA S139 / 1 sebagai kontrol. (B) Darah dikumpulkan 14 hari setelah pDNA / EP dan dianalisis untuk total mZMapp

C

D

konsentrasi dengan ELISA. Setiap titik mewakili nilainya dari mouse individu. Bar kesalahan menunjukkan rata-rata ± SEM. (C) Tikus ditantang 28 –31 hari setelahnya administrasi pDNA / EP dengan 100 PFU mouse-adapted virus Ebola dan dimonitor untuk mematikan selama 21 hari. Itu Plot Kaplan-Meier yang menggambarkan kelangsungan hidup diperlihatkan. Significance (p <0,0001, uji peringkat log) dilaporkan untuk masing-masing kelompok yang di-electroporated dengan DNA encoding mZMapp dibandingkan dengan kelompok kontrol. (D) Tikus-tikus itu dipantau setiap hari untuk memulai tanda-tanda penyakit berikut tantangan, dan plot Kaplan-Meier yang menggambarkan hewan

sisa bebas dari tanda penyakit ditampilkan.

penskalaan dari tikus ke manusia, yang mungkin ditangani sebagian oleh mAbs teknik dengan peningkatan farmakokinetik dan vektor plasmid dengan ekspresi yang ditingkatkan. 50 Selain itu, penting untuk dicatat bahwa peralatan dan kondisi EP dalam penggunaan klinis saat ini telah dideklarasikan beberapa tahun yang lalu. Kemajuan terbaru dibuat di bidang EP in vivo kemungkinan akan meningkatkan tingkat ekspresi. 51 Selanjutnya, sampai saat ini, EP sebagian besar telah diterapkan untuk vaksinasi DNA, di mana tingkat tertentu kematian sel dan peradangan adalah manfaat resmi untuk generasi respon imun. Di sisi lain, produksi mAb yang persisten dan berkepanjangan di vivo menuntut parameter EP yang meminimalkan kematian sel dan pengenalan kekebalan. Oleh karena itu kami dengan tegas percaya ada banyak ruang untuk EP optimasi (pengaturan medan listrik fi dan array elektroda) yang bisa mengatasi tantangan dalam mouse ke manusia skala-up. Jika berhasil, transfer gen melalui pDNA / EP dapat menjadi teknologi platform transformatif yang menurunkan biaya dan akses ex-pands ke terapi mAb di seluruh dunia.

MATERIAL DAN METODE Konstruksi Plasmid

Semua kaset ekspresi 5A8 secara terpisah dikonstruksi oleh PCR ampli fi kasi dan secara terpisah dikloning ke dalam plasmid ekspresi pVAX1 di Nhe I dan Xho I restriction sites. IgG2a H- dan L-chain DNA encoding C179, 25 S139 / 1 (GenBank: 4GMT_I dan 4GMT_M), 9H10 (disediakan oleh Dr. Peter Palese), 2G4 (paten US20120283414), 4G7 (paten US20120283414), dan 13C6 (paten US6875433 B2) yang dioptimalkan dan disintesis (GeneArt Gene Sintesis, Thermo Fisher ilmiah fi c, Waltham, MA, USA) dan kloning secara terpisah ke dalam pVAX1 atau gWiz ekspresi plasmid. pDNA diisolasi menggunakan EndoFree Plasmid Maxi kits (QIAGEN, Valencia, CA,

AMERIKA SERIKAT). Hasil DNA dan kualitas yang con fi rmed oleh spektrofotometri dan elektroforesis gel agarosa. Produksi dan Kuantifikasi Virus Influenza

Strain A / WSN / 33 yang diadaptasi oleh tikus diperoleh dengan melewatkan virus tujuh kali pada tikus BALB / c seperti yang dijelaskan sebelumnya. 52 The MLD 50 ditentukan dalam BALB / c tikus. Mouse-disesuaikan, BALB / c-titrated A / Aichi / 2/68 disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya. 53 Mice, EP, dan Tantangan Virus Pernyataan Etika Hewan

Hewan-hewan dipelihara di Pusat Bioscience Komparatif Universitas Rockefeller atau di fasilitas Penelitian Penyakit Medis Angkatan Darat AS (USAMRIID) sesuai dengan peraturan Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional (IACUC) dari lembaga perumahan. Semua penelitian pada hewan dilakukan di bawah protokol yang disetujui oleh IACUC The Rockefeller University atau USAMRIID sesuai dengan Undang-Undang Kesejahteraan Hewan dan undang-undang federal lainnya dan peraturan yang berkaitan dengan hewan dan eksperimen yang melibatkan hewan. Administrasi pDNA / EP

Tikus BALB / c betina berumur enam sampai sepuluh minggu (Charles Rivers Labora-tories) diberikan pDNA dengan injeksi im dengan EP menggunakan Sistem Pengiriman TriGrid (Ichor Medical Systems, San Diego, CA, USA) menggunakan kondisi yang dijelaskan sebelumnya. 48 Brie fl y, array elec-trode terdiri dari susunan dari empat elektroda jarum-jenis penetras yang panjangnya 4 mm yang disusun dalam dua sudut tri-sudut yang saling menyambung untuk membentuk bentuk intan dengan jarak intraelektroda dari

Terapi Molekuler: Metode & Pengembangan Klinis Vol. 7 Desember 2017 79

2,5 mm. Array elektroda termasuk port injeksi sentral yang dirancang untuk berinteraksi dengan jarum suntik insulin 0,3 cc dan jarum suntik 30G (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NY, USA). Selama admin-istration, array elektroda dan jarum suntik dimasukkan ke situs administrasi target dengan sumbu utama dari array sejajar dengan orientasi otot fi. bers di tempat suntikan. Setelah injeksi DNA, stimulasi listrik diterapkan melalui rangkaian elektroda di sekitarnya pada amplitudo 62,5 V (250 V / cm jarak elektroda) untuk durasi 40 ms diterapkan selama 400 ms (10% tugas). siklus). Untuk pretreatment hyaluronidase, tikus diinjeksi dengan bovine hyaluronidase (Sigma, St. Louis, MO, USA) atau PBS 2 jam sebelum injeksi pDNA dengan EP. Untuk eksperimen oligoklonal, pengkodean pDNA H-dan rantaiL dari satu antibodi dicampur, dan pDNA menyandikan masing-masing antibodi disuntikkan pada otot di tungkai terpisah untuk menghasilkan antibodi otentik. Tikus berdarah retroorbitally, dan serum diisolasi dan dibekukan sampai analisis.

Profilaksis Influenza pada Tikus

Dalam fl virus influenza dicairkan dan diencerkan dalam PBS untuk memberikan dosis yang ditunjukkan di 30 m L. Mencit terbius oleh iso fl URANE inhalasi, dan 15 m L virus diencerkan ditanamkan ke dalam setiap lubang hidung. Tikus ditimbang setiap hari selama 10 hari setelah tantangan dan pengorbanan fi CED ketika penurunan berat badan adalah> 20% dari berat mulai sesuai peraturan IACUC. Jumlah hewan per kelompok dihitung untuk memperoleh perbedaan statistik antara tidak ada kelangsungan hidup pada kelompok kontrol dan setidaknya 70% efektifitas pada kelompok yang diobati dengan> 90% daya menggunakan tingkat alpha dua sisi 0,05. Profilaksis Virus Ebola pada Tikus

Tikus ditempatkan di Comparative Bioscience Center of The Rockefeller University dan mengelola pDNA / EP seperti yang dijelaskan. Tikus yang telah diairi kemudian diangkut ke fasilitas hewan penahanan Biosafety Level 4 di USAMRIID, di mana model tikus virus Ebola yang diautentikasi tikus mati yang divalidasi secara menyeluruh dikembangkan. 54 Tikus ditantang secara intraperitoneal dengan 100 PFU virus Ebola yang diadaptasi oleh tikus (strain 1976, Mayinga 35 ) dan dipantau setiap hari selama 21 hari pascainfeksi. Jumlah hewan per kelompok (n = 20) dihitung untuk memperoleh perbedaan statistik antara 10% kelangsungan hidup pada kelompok kontrol dan setidaknya 50% efektif pada kelompok yang diberi perlakuan dengan> 90% daya menggunakan tingkat alpha dua sisi 0,05. ELISA Deteksi 5A8 oleh sCD4 Binding

Pelat dilapisi dengan CD4 yang dapat larut manusia diblokir dan diinkubasi dengan serum tikus selama 1 jam. Pengikatan dideteksi dengan menggunakan horseradish peroxidase (HRP) -gugat anti-tikus terkonjugasi IgG1 H & L (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) atau antibodi anti-mouse konjugasi alkali fosfatase (AP), dan dikembangkan oleh 3,3 0 , 5, 5 0 -tetramethylbenzidine (TMB) atau kit AMPAK (DAKO; Carpinteria, CA, USA). konsentrasi mAb ditentukan dengan membandingkan nilai absorbansi dengan kurva pengikat CD4 protein 5A8 puri fi ed.

Terapi Molekuler: Metode & Pengembangan Klinis

Deteksi Mouse Anti-Influenza mAbs C179, S139 / 1, dan 9H10

Untuk penelitian ekspresi-bersama, untuk membedakan ekspresi S139 / 1 dan 9H10, keduanya mengenali epitop H3, S139 / 1 dideteksi menggunakan subunit HA1 dan 9H10 dideteksi dengan H10N8. Pelat ELISA dilapisi dengan 200 ng H1N1 (A / WSN / 33) HA, 50 ng H3N2 (A / Aichi / 2/1968) HA1 atau HA subunit, atau 200 ng H10N8 (A / Jiangxi-Donghu / 346/2013 ) HA (Sino Biologicals, Beijing, China) diblokir dan diinkubasi dengan serum tikus yang diencerkan secara serial. Setelah dicuci, kambing anti-tikus IgG HRP ditambahkan selama 1 jam pada 37 C. Bound mAb dideteksi menggunakan TMB Liquid Substrate (Sigma) dan berhenti dengan 1N H 2 SO 4 . Spektrofotometri pembacaan per-dibentuk pada 450 nm dengan pengurangan referensi 570 nm. Puri fi ed protein digunakan untuk kurva standar. Deteksi Mouse Anti-Ebola mAbs 2G4, 4G7, dan 13C6

Pelat ELISA dilapisi dengan 100 ng Zaire GP D TM dalam 0,1 M NaHCO 3 (pH 9,6) per semalam dalam 4 C. Pelat dicuci dan diblokir dengan 5% susu dan 0,5% BSA dalam PBS mengandung 0,05% Tween 20. Mouse sera secara serial diencerkan dalam memblokir buffer dan diinkubasi pada pelat ELISA selama 1 jam pada 37 C. Setelah pencucian, kambing anti-tikus IgG HRP (Enzo Life Sciences, Plymouth Meeting, PA, USA) ditambahkan selama 1 jam pada 37 C. Bound mAb dideteksi menggunakan TMB Liquid Substrate (Sigma) dan berhenti dengan 1N H 2 SO 4 . Pembacaan spec-trophotometric dilakukan pada 450 nm dengan pengurangan referensi 570 nm. Puri fi ed protein digunakan untuk kurva standar. Metode Statistik

Semua perbandingan statistik dilakukan menggunakan GraphPad Prism Software, versi 6 (La Jolla, CA, USA). Uji t two-tailed berpasangan digunakan untuk menilai perbedaan penurunan berat badan pada tikus yang bertahan hidup. Perbedaan kelangsungan hidup dianalisis menggunakan uji peringkat log Mantel-Cox dengan koreksi Bonferroni dilakukan untuk beberapa perbandingan.

INFORMASI SUPLEMEN Informasi Tambahan termasuk Bahan dan Metode Tambahan dan tujuh gambar dan dapat ditemukan dengan artikel ini secara online di https://doi.org/10.1016/j.omtm.2017.09.003 .

KONTRIBUSI PENULIS CDA, YL, MS, JY, AJG, PJG, dan YH melakukan percobaan dan analisis data. CDA, YL, AJG, PJG, NNP, YH, dan DDH menyusun penelitian dan merancang eksperimen. CDA, YH, dan DDH menulis naskah dengan komentar dari semua penulis.

KONFLIK KEPENTINGAN CDA, JY, NNP, YH, dan DDH adalah konsultan untuk RenBio, Inc., perusahaan yang mengembangkan teknologi platform transfer gen, dan YH dan DDH adalah salah satu pendiri RenBio, Inc.

80

Terapi Molekuler: Metode & Pengembangan Klinis Vol. 7 Desember 2017

www.moleculartherapy.org

UCAPAN TERIMA KASIH Kami berterima kasih kepada Mar Boente-Carrera, Mili R. Gajjar, dan Lily Tsai untuk bantuan teknis dengan eksperimen dan anggota laboratorium Ho untuk diskusi yang bermanfaat. Kami berterima kasih kepada Joshua Shamblin, Suzanne Wollen, Adrienne Kimmel, dan Ashley Piper untuk bantuan teknis untuk studi tantangan Ebola in vivo. Kami berterima kasih kepada Ichor Medical Systems yang telah menyediakan perangkat elektroporasi, Dr. Peter Palese yang dengan baik menyediakan rangkaian antibodi A / WSN / 33 dan 9H10, dan Drs. Richard W. Compans dan Ioanna Skountzou untuk menyediakan virus A / Aichi / 2/68. DDH didukung oleh Bill dan Melinda Gates Foundation ' Kolaborasi karena AIDS Vaccine Discovery (hibah OPP1040731), Defense Advanced Research Pro-jects Agency (kontrak W31PQ4-14-1-0010), dan Penelitian Army Of fi ce melalui subkontrak kontrak W911NF-14-C-0001 yang diberikan sehubungan dengan Defense Advanced Research Pro-jects Badan ' Program PROTECT ADEPT s. Ini fi temuan tidak selalu kembali fl ect posisi atau kebijakan Pemerintah, dan tidak ada dari fi resmi dukungan harus disimpulkan.

REFERENSI 1.

Ecker, DM, Jones, SD, dan Levine, HL (2015). Pasar anti- tubuh monoklonal terapeutik . MAbs 7 , 9 - 14 .

2.

Blackstone, EA, dan Joseph, PF (2013). Ekonomi biosimilars. Saya. Kesehatan Obat Bene fi ts 6 , 469 - 478 .

3. Skaricic, D., Traube, C., De, B., Joh, J., Boyer, J., Crystal, RG, dan Worgall, S. (2008). Pengiriman genetik antibodi anti-RSV untuk melindungi terhadap infeksi paru dengan RSV. Virologi 378 , 79 - 85 . 4. Johnson, PR, Schnepp, BC, Zhang, J., Connell, MJ, Greene, SM, Yuste, E., Desrosiers, RC, dan Clark, KR (2009). Transfer gen yang diperantarai vektor menghasilkan aktivitas penetral yang berumur panjang dan perlindungan terhadap infeksi SIV pada monyet. Nat. Med. 15 , 901 - 906 . 5. Balazs, AB, Chen, J., Hong, CM, Rao, DS, Yang, L., dan Baltimore, D. (2011). Proteksi berbasis antibodi terhadap infeksi HIV dengan imunoprofilaksis vektor. Nature 481 , 81 - 84 . 6. Limberis, MP, Adam, VS, Wong, G., Gren, J., Kobasa, D., Ross, TM, Kobinger, GP, Tretiakova, A., dan Wilson, JM (2013). Intranasal antibodi transfer gen dalam tikus dan musang memunculkan perlindungan luas terhadap pandemi di fl influenza. Sci. Terjemahan Med. 5 , 187ra72 . 7. Limberis, MP, Racine, T., Kobasa, D., Li, Y., Gao, GF, Kobinger, G., dan Wilson, JM (2013). Vektor ekspresi antibodi FI6 yang secara luas menetralkan dalam saluran udara tikus memberikan perlindungan parsial terhadap virus avian fl Aenza baru, H7N9. Clin. Vaksin Imunol. 20 , 1836 - 1837 . 8. Balazs, AB, Bloom, JD, Hong, CM, Rao, DS, dan Baltimore, D. (2013). Luas perlindungan terhadap infeksi fl uenza dengan imunoprofilaksis vektor pada tikus. Nat. Biotechnol. 31 , 647 - 652 . 9. Ferraro, B., Morrow, MP, Hutnick, NA, Shin, TH, Lucke, CE, dan Weiner, DB (2011). Aplikasi klinis vaksin DNA: kemajuan saat ini. Clin. Menulari. Dis. 53 , 296 - 302 . 10. Satkauskas, S., André, F., Biro, MF, Scherman, D., Miklavcic, D., dan Mir, LM (2005). Komponen elektroforesis pulsa listrik menentukan ef fi keampuhan dari in vivo electrotransfer DNA. Bersenandung. Gene Ther. 16 , 1194 - 1201 . 11. Yamazaki, T., Nagashima, M., Ninomiya, D., Arai, Y., Teshima, Y., Fujimoto, A., Ainai, A., Hasegawa, H., dan Chiba, J. (2011). Pasif kekebalan profilaksis terhadap di fl infeksi virus influenza dengan ekspresi menetralisir anti-hemagglutinin mono antibodi klonal dari plasmid. Jpn. J. Menginfeksi. Dis. 64 , 40 - 49 .

12. Elliott, STC, Kallewaard, NL, Benjamin, E., Wachter-Rosati, L., McAuliffe, JM, Patel, A., et al. (2017). DMAb inokulasi antibodi lintas sintetis reaktif pro tects terhadap mematikan di fl infeksi influenza A dan B. npj Vaksin 2 , 18 .

13. Flingai, S., Plummer, EM, Patel, A., Shresta, S., Mendoza, JM, Broderick, KE, Sardesai, NY, Muthumani, K., dan Weiner, DB (2015). Perlindungan terhadap penyakit dengue oleh prophylaxis / imunoterapi asam nukleat sintetis. Sci. Rep. 5 , 12616 . 14. Muthumani, K., Block, P., Flingai, S., Muruganantham, N., Chaaithanya, IK, Tingey, C., Wise, M., Reuschel, EL, Chung, C., Muthumani, A., dkk. . (2016). Imunitas cepat dan jangka panjang yang ditimbulkan oleh profilaksis antibodi yang dikodekan DNA dan vaksin DNA terhadap virus Chikungunya. J. Menginfeksi. Dis. 214 , 369 - 378 . 15. Perez, N., Bigey, P., Scherman, D., Danos, O., Piechaczyk, M., dan Pelegrin, M. (2004). Produksi sistemik tersusun antibodi monoklonal dengan elektroporasi otot in vivo . Genet. Vaksin Ther. 2 , 2 . 16. Tjelle, TE, Corthay, A., Lunde, E., Sandlie, I., Michaelsen, TE, Mathiesen, I., dan Bogen, B. (2004). Antibodi monoklonal diproduksi oleh otot setelah injeksi plasmid dan elektroporasi. Mol. Ther. 9 , 328 - 336 . 17. Muthumani, K., Flingai, S., Wise, M., Tingey, C., Ugen, KE, dan Weiner, DB (2013). Dioptimalkan dan ditingkatkan DNA plasmid vektor yang berbasis in vivo konstruksi anti-HIV-1 amplop glikoprotein Fab. Bersenandung. Vaccin. Immunother. 9 , 2253 - 2262 . 18. Kuritzkes, DR, Jacobson, J., Bubuk, WG, Godofsky, E., DeJesus, E., Haas, F., Reimann, KA, Larson, JL, Yarbough, PO, Curt, V., dan Shanahan, WR, Jr. (2004). Aktivitas antiretroviral antibodi monoklonal anti-CD4 TNX-355 pada pasien yang terinfeksi dengan HIV tipe 1. J. Infect. Dis. 189 , 286 - 291 . 19.

Dimitrov, A. (2007). Ibalizumab, CD4-spesifik fi c mAb untuk menghambat infeksi HIV-1. Curr. Opin. Investig. Obat 8 , 653 - 661 .

20. Fang, J., Qian, JJ, Yi, S., Harding, TC, Tu, GH, VanRoey, M., dan Jooss, K. (2005). Ekspresi antibodi yang stabil pada tingkat terapeutik menggunakan peptida 2A. Nat. Biotechnol. 23 , 584 - 590 . 21. McMahon, JM, Signori, E., Wells, KE, Fazio, VM, dan Wells, DJ (2001). Optimalisasi electrotransfer dari plasmid ke otot skeletal dengan pretreatment dengan hyaluronidase - peningkatan ekspresi dengan kerusakan otot yang berkurang. Gene Ther. 8 , 1264 - 1270 . 22. Schertzer, JD, Plant, DR, dan Lynch, GS (2006). Mengoptimalkan transfer gen berbasis plasmid untuk menyelidiki struktur dan fungsi otot skeletal. Mol. Ther. 13 , 795 - 803 . 23. Mennuni, C., Calvaruso, F., Zampaglione, I., Rizzuto, G., Rinaudo, D., Dammassa, E., Ciliberto, G., Fattori, E., dan La Monica, N. (2002). Hialuronidase meningkat elektro transfer gen ef fi siensi di otot rangka. Bersenandung. Gene Ther. 13 , 355 - 365 . 24.

Williams, JA (2013). Desain vektor untuk meningkatkan vaksin DNA ef fi khasiat, keamanan dan produksi. Vaksin (Basel) 1 , 225 - 249 .

25. Okuno, Y., Isegawa, Y., Sasao, F., dan Ueda, S. (1993). Sebuah penetral umum epitop dilestarikan antara hemagglutinins dari di fl influenza A H1 virus dan H2 strain. J. Virol. 67 , 2552 - 2558 . 26. Yoshida, R., Igarashi, M., Ozaki, H., Kishida, N., Tomabechi, D., Kida, H., Ito, K., dan Takada, A. (2009). Potensial lintas pelindung dari antibodi monoklonal baru yang ditujukan terhadap situs antigenik B dari hemagglutinin dari di fl influenza A virus. PLoS Pathog. 5 , e1000350 . 27. DiLillo, DJ, Tan, GS, Palese, P., dan Ravetch, JV (2014). Luas menetralisir Hem agglutinin tangkai-spesifik fi antibodi c memerlukan Fc g R interaksi untuk perlindungan terhadap di fl virus influenza in vivo. Nat. Med. 20 , 143 - 151 . 28. DiLillo, DJ, Palese, P., Wilson, PC, dan Ravetch, JV (2016). Secara menetralisir anti-in fl antibodi influenza membutuhkan Fc keterlibatan reseptor untuk perlindungan in vivo.

J.

Clin. Menginvestasikan. 126 , 605 - 610 .

29. Tan, GS, Lee, PS, Hoffman, RM, Mazel-Sanchez, B., Krammer, F., Leon, PE, Ward, AB, Wilson, IA, dan Palese, P. (2014). Karakterisasi antibodi monoklonal yang menetralkan secara luas yang menargetkan domain fusi grup 2 di fl uenza

SEBUAH virus hemagglutinin. J. Virol. 88 , 13580 - 13592 . 30. Wec, AZ, Herbert, AS, Murin, CD, Nyakatura, EK, Abelson, DM, Fels, JM, Dia, S., James, RM, de La Vega, MA, Zhu, W., et al. (2017). Antibodi dari manusia yang selamat de fi ne situs kerentanan untuk perlindungan luas terhadap Ebolavirus. Sel 169 , 878 - 890.e815 .

Terapi Molekuler: Metode & Pengembangan Klinis Vol. 7 Desember 2017 81

Terapi Molekuler: Metode & Pengembangan Klinis

31. Qiu, X., Wong, G., Audet, J., Bello, A., Fernando, L., Alimonti, JB, Fausther- Bovendo, H., Wei, H., Aviles, J., Hiatt, E. , et al. (2014). Pembalikan penyakit virus Ebola lanjut pada primata non-manusia dengan ZMapp. Nature 514 , 47 - 53 . 32. Wilson, JA, Hevey, M., Bakken, R., Tamu, S., Bray, M., Schmaljohn, AL, dan Hart, MK (2000). Epitop terlibat dalam perlindungan yang dimediasi antibodi dari virus Ebola. Sains 287 , 1664 - 1666 . 33. Qiu, X., Fernando, L., Melito, PL, Audet, J., Feldmann, H., Kobinger, G., Alimonti, JB, dan Jones, SM (2012). Ebola GP-speci fi c antibodi monoklonal melindungi tikus dan babi guinea dari infeksi virus Ebola yang mematikan. PLoS Negl. Trop. Dis. 6 , e1575 .

34. Limberis, MP, Tretiakova, A., Nambiar, K., Wong, G., Racine, T., Crosariol, M., Xiangguo, Q., Kobinger, G., dan Wilson, JM (2016). Aden-associated virus serotype 9-menyatakan ZMapp pada tikus memberikan perlindungan terhadap infeksi virus Ebola sistemik dan saluran udara. J. Menginfeksi. Dis. 214 , 1975 - 1979 . 35.

Bray, M., Davis, K., Geisbert, T., Schmaljohn, C., dan Huggins, J. (1999). Seekor tikus

model untuk evaluasi profilaksis dan terapi demam hemoragik Ebola. J. Menginfeksi. Dis. 179 ( Suppl 1 ), S248 - S258 . 36. Ho, RJY, dan Gibaldi, M. (2013). Antibodi dan turunannya. Dalam Bioteknologi dan Biofarmasi: Mengubah Protein dan Gen menjadi Obat, Edisi Kedua, RJY Ho, ed. (Wiley-Blackwell), hlm 139 - 210 . 37. Throsby, M., van den Brink, E., Jongeneelen, M., Poon, LL, Alard, P., Cornelissen, L., Bakker, A., Cox, F., van Deventer, E., Guan, Y ., dkk. (2008). Antibodi monoklonal antibodi netralisasi monostlastik yang silang terhadap H5N1 dan H1N1 pulih dari sel ingatan manusia IgM + B. PLoS ONE 3 , e3942 . 38. Corti, D., Voss, J., Gamblin, SJ, Codoni, G., Macagno, A., Jarrossay, D., Vachieri, SG, Pinna, D., Minola, A., Vanzetta, F., et al . (2011). Antibodi penetralisir dipilih dari sel plasma yang berikatan dengan grup 1 dan grup 2 di fl uenza A hemagglutinin. Sains 333 , 850 - 856 . 39. Bornholdt, ZA, Turner, HL, Murin, CD, Li, W., Sok, D., Souders, CA, Piper, AE, Goff, A., Shamblin, JD, Wollen, SE, dkk. (2016). Isolasi antibodi penetralisir yang kuat dari seorang yang selamat dari wabah virus Ebola tahun 2014. Sains 351 , 1078 - 1083 .

40. Wang, W., Sun, X., Li, Y., Su, J., Ling, Z., Zhang, T., Wang, F., Zhang, H., Chen, H., Ding, J., dan Sun, B. (2016). 3E1 antibodi manusia menargetkan HA wilayah batang H1N1 dan H5N6 di fl virus influenza A. Nat. Komunike. 7 , 13577 . 41. Corti, D., Misasi, J., Mulangu, S., Stanley, DA, Kanekiyo, M., Wollen, S., Ploquin, A., Doria-Rose, NA, Staupe, RP, Bailey, M., et Al. (2016). Monoterapi pelindung terhadap infeksi virus Ebola yang mematikan oleh antibodi penawar yang poten. Sains 351 , 1339 - 1342 . 42.

Misasi, J., Gilman, MS, Kanekiyo, M., Gui, M., Cagigi, A., Mulangu, S., Corti, D., Ledgerwood, JE, Lanzavecchia, A., Cunningham, J., et al . (2016). Struktural dan

dasar molekuler untuk netralisasi virus Ebola oleh antibodi manusia pelindung. Sains 351 , 1343 - 1346 . 43. Dreyfus, C., Laursen, NS, Kwaks, T., Zuijdgeest, D., Khayat, R., Ekiert, DC, Lee, JH, Metlagel, Z., Bujny, MV, Jongeneelen, M., et al. (2012). Sangat kekal epitop pelindung pada di fl virus influenza B. Sains 337 , 1343 - 1348 . 44. Flyak, AI, Shen, X., Murin, CD, Turner, HL, David, JA, Fusco, ML, Lampley, R., Kose, N., Ilinykh, PA, Kuzmina, N., et al. (2016). Respons antibodi netralisasi yang reaktif dan silang pada manusia yang selamat dari infeksi Ebolavirus alami. Sel 164 , 392 - 405 . 45.

Balazs, AB, dan West, AP, Jr. (2013). Transfer gen antibodi untuk imunoprofilaksis HIV . Nat. Immunol. 14 , 1 - 5 .

46.

Sahin, U., Karikó, K., dan Türeci, Ö. (2014). terapi berbasis mRNA - mengembangkan kelas baru obat-obatan. Nat. Pdt. Obat Discov. 13 , 759 - 780 .

47. Pardi, N., Tuyishime, S., Muramatsu, H., Kariko, K., Mui, BL, Tam, YK, Madden, TD, Harapan, MJ, dan Weissman, D. (2015). Kinetika ekspresi nucleoside-memodi- fi ed mRNA disampaikan dalam nanopartikel lipid tikus oleh berbagai rute. J. Kontrol. Rilis 217 , 345 - 351 . 48. Hannaman, D. (2012). Elektroporasi berdasarkan Trigrid R. Weiss, dan S. Scheiblhofer, eds. (Springer) .

TM

Delivery System (TDS) untuk administrasi vaksin DNA. Dalam Vaksin Gene, J. Thalhamer,

49. Vasan, S., Hurley, A., Schlesinger, SJ, Hannaman, D., Gardiner, DF, Dugin, DP, Boente-Carrera, M., Vittorino, R., Caskey, M., Andersen, J., et Al. (2011). Elektroporasi in vivo meningkatkan imunogenisitas calon vaksin DNA HIV-1 pada sukarelawan yang sehat. PLoS ONE 6 , e19252 . 50.

Kay, MA, He, CY, dan Chen, ZY (2010). Sistem yang kuat untuk produksi vektor DNA minikircle. Nat. Biotechnol. 28 , 1287 - 1289 .

51. .

Rosazza, C., Meglic, SH, Zumbusch, A., Rols, MP, dan Miklavcic, D. (2016). Gene electrotransfer: perspektif mekanistik. Curr. Gene Ther. 16 , 98 - 129

52.

Cottey, R., Rowe, CA, dan Bender, BS (2001). Dalam fl virus influenza. Curr. Protoc. Immunol. Bab 19 . Unit 19.11 .

53. Koutsonanos, DG, del Pilar Martin, M., Zarnitsyn, VG, Sullivan, SP, Compans, RW, Prausnitz, MR, dan Skountzou, I. (2009). Transdermal dalam imunisasi fl uenza dengan salutan mikroneedle yang dilapisi vaksin. PLoS ONE 4 , e4773 . 54. Gibb, TR, Bray, M., Geisbert, TW, Steele, KE, Kell, WM, Davis, KJ, dan Jaax, NK (2001). Patogenesis infeksi virus Ebola Zaire eksperimental pada tikus BALB / c . J. Comp. Pathol. 125 , 233 - 242 .

82

Terapi Molekuler: Metode & Pengembangan Klinis Vol. 7 Desember 2017