34656_prosedur Biotek Perancangan Primer.docx

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI FARMASI PERANCANGAN PRIMER

Dosen Pengampu : Bawon Triatmoko, S.Farm, M.Farm., Apt.

Oleh: Afalah Zulfa Laily

(162210101118)

BAGIAN BIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2018

KATA PENGANTAR Assalamu’alaikum Warahmatullahi Wabarakatuh Alhamdulillahirabbila’alamin, berkat nikmat, taufik, rahmat serta hidayah-Nya, penulis dapat menyelesaikan laporan praktikum Bioteknologi Farmasi dengan judul “Perancangan Primer”. Dalam penyusunan, penulis banyak memperoleh bantuan dari berbagai pihak sehingga penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Ibu Endah Puspitasari, S.Farm., M.Sc., Apt selaku dosen Pengampu mata kuliah Bioteknologi Farmasi serta teman-temanku. Penulisan tugas laporan ini tidak akan selesai tanpa kontribusi dari berbagai pihak. Demikian atas penulisan laporan ini, jika terdapat kesalahan gelar maupun tulisan, penulis mohon maaf yang sebesar-besarnya. Wassalamu’alaikum Warahmatullahi Wabarakatuh.

Jember, Mei 2018

Penulis

KATA PENGANTAR ............................................................................................. 2 BAB 1

PENDAHULUAN ............................................................................................................. 4

1.1

Latar Belakang ............................................................................................................... 4

1.2

RUMUSAN MASALAH .................................................................................................... 4

1.3

TUJUAN.......................................................................................................................... 5

1.

Mengetahui cara perancangan primer secara online ....................................................... 5

BAB 2

DASAR TEORI ................................................................................................................. 6

2.1

PCR ............................................................................................................................ 6

2.2

Perancangan Primer .................................................................................................. 8

2.3

Persyaratan Primer yang baik ................................................................................... 9

BAB 3

BAB 4

METODE ...................................................................................................................... 10 3.1

Alat dan Bahan .................................................................................................... 10

3.2

Cara Kerja ............................................................................................................ 10

HASIL ........................................................................................................................... 12 4.1

BAB 5

PEMBAHASAN ............................................................................................................. 25 5.1

Primer .......................................................................................................... 25

5.2

Primer dari gen IL6 ..................................................................................... 25

1. BAB 6

Hasil Pengamatan ............................................................................................ 12

Primer 3 ........................................................................................................... 26

PENUTUP ..................................................................................................................... 28 6.1 Kesimpulan ................................................................................................. 28 6.2 Saran........................................................................................................... 28 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 29

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik biologi molekuler yang memiliki tingkat sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi. Dengan penggunaan teknik PCR maka keberadaan penyakit pada organisme dapat diketahui sedini mungkin, sehingga dapat dilakukan langkah pengendalian penyakit atau tindakan oleh para pengambil kebijakan, terutama dalam budidaya perikanan. Perkembangan

jaringan

internet

mendukung

berkembangnya

bioinformatika tentang perncangan primer. Pangkatan data yang terhubung melalui internet memudahkan ilmuwan dalam mengumpulkan hasil sekuensing dalam pangkalan data sehingga memperoleh sekuens biologi sebagai bahan analisis. Pengorganisasian data yang ada sangat berguna untuk analisis yang lebih baik. Dari

uraian

diatas

terlihat

bahwa

perancangan

primer

sangat

mempengaruhi kehidupan manusia, terutama untuk mencapai kehidupan yang lebih baik. Dengan menganalisis protein menggunakan komputasi dapat memudahkan manusia dalam memperoleh data primer protein dan pasangan primer protein

1.2 RUMUSAN MASALAH 1.

Bagaimana cara melakukan perancangan primer secara online?

2.

Bagaimana cara menentukan primer yang baik?

3.

Bagaimana cara menentukan spesifitas primer?

1.3 TUJUAN 1. Mengetahui cara perancangan primer secara online 2. Mengetahui cara menentukan primer yang baik 3. Mengetahui cara menentukan spesifitas primer yang baik

BAB 2

DASAR TEORI

2.1 PCR PCR (polimerase chain reaction) salah satu teknik untuk mempelajari biologi molekuler, merupakan metode enzimatis yang digunakan untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara in vitro. Metode ini sangat sensitif, sehingga dapat digunakan untuk melipatgandakan satu molekul DNA. Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat dilakukan. Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitu sekuen oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali

sintesis

rantai

DNA

dalam

reaksi

berantai

polimerase.

Pengembangan lebih lanjut metode PCR memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA yang belum diketahui sekuennya, misalnya dengan metode Alu- PCR (Rosenthal, 1992). Alu adalah suatu sekuen DNA (panjangnya kurang lebih 300 bp) yang banyak terdapat sepanjang genom manusia (repetitive DNA sequence). Alu-PCR adalah metode PCR yang memanfaatkan sekuen-sekuen Alu sebagai dasar untuk membuat primer untuk melipatgandakan suatu fragmen DNA yang belum diketahui sekuen yang terdepat di antara dua sekuen Alu. Keberhasilan PCR ditentukan oleh beberapa faktor, antara lain: 1. Deosiribonukleotida trifosfat (dNTP). Larutan stok dNTP yang akan digunakan dalam PCR sebaiknya dinetralkan menjadi pH 7,0. Untuk menentukan konsentrasinya, dapat digunakan spektrofotometer. Larutan stock tersebut perlu dituang dalam volume kecil (aliquot) dengsn konsentrasi 1Mm dan disimpan pada suhu -20oC. Konsentrasi masing-masing dNTP yang diperlukan dalam PCR berkisar antara 20-200μM dan keempat dNTP yang digunakan sebaiknya 2. Oligonukleotida primer 3. DNA template 4. Komposisi larutan buffer

5. Jumlah siklus reaksi 6. Enzim yang digunakan, dan 7. Faktor teknis dan faktor non teknis lainnya, misalnya kontaminasi

Tahapan PCR yang paling menentukan adalah penempelan primer. Sepasang primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan dipolimerisasi masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya pada kedua ujung fragmen yang akan diamplifikasi. Untuk itu urutan basanya harus komplementer atau setidak-tidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan basa kedua daerah ujung fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum mengetahui dengan pasti urutan basa sekuens target. Oleh karena itu, diperlukan cara tertentu untuk merancang urutan basa kedua primer yang akan digunakan. Urutan basa pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis menggunakan program komputer untuk mengetahui kemungkinan terjadinya primer-dimer akibat homologi sendiri (self-homology) atau homologi silang (cross-homology). Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinya salah tempel (mispriming), yaitu penempelan primer di luar sekuens target.

2.2 Perancangan Primer Studi perancangan primer merupaka kajian awal yang memudahkan pekerjaan molekuler terhadap suatu gen menggunakan teknik PCR komputer dalam kegiatan rekayasa genetika terpadu. Perancangan primer oligonukleotida memegang peran yang sangat penting dalam kegiatan biologi molekuler. Perancangan ini diharapkan akan menghasilkan primer spesifik yang dapat digunakan dalam proses perbanyakan (amplifikasi) DNA. Primer adalah nukleotida pendek berukuran 12-20 basa yang diperlukan sebagai titik pelekatan enzim polimerase DNA pada proses pembentukan atau pemanjangan DNA suatu gen spesifik secara in vitro melalui teknik reaksi rantai polimerisasi (polymerase chain reaction, PCR). Teknik PCR ditemukan secara tidak sengaja oleh Kary Mullis pada tahun 1989. Sebelum penemuan tersebut, para ahli telah mengetahui bahwa penggandaan materi genetik dapat terjadi di dalam tubuh (in-vivo) dan merupakan mekanisme yang umum. Namun, penemuan tersebut membuktikan bahwa reaksi polimerisasi DNA dapat juga terjadi di dalam tabung (in-vitro). Implementasi teknik PCR pada polimerisasi gen sukrosa sintase membutuhkan teknik perancangan primer yang tepat sehingga menghasilkan primer spesifik untuk deteksi gen. Perancangan primer untuk gen yang berperan dalam metabolisme karbohidrat, sukrosa sintase, dapat dilakukan dengan memanfaatkan kode sekuens yang tersedia dan mudah diperoleh di internet pada beberapa situs, yaitu GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) yang mencakup koleksi data sekuens di Amerika, European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute / EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk) mencakup Eropa, dan DDBJ (www.ddbj.nig.ac.jp) di Jepang. Ketiga situs tersebut saling bertukar informasi basis data sehingga tidak terjadi duplikasi data dan dengan cepat terjadi pembaharuan data.

Penggunaan piranti lunak (software) Clustal-W dan NetPrimer telah memberikan kemudahan dalam perancangan ini. Software tersebut dapat dengan mudah dan cepat dieksekusi melalui hubungan komputer-internet. Dengan demikian, bioinformatika di Indonesia harus segera menjembatani para ahli genetika, biologi molekuler, biokimia, dan ilmu komputer dalam kegiatan rekayasa genetika secara terpadu. Penggunaan data GeneBank, software Clustal-W (Hinggins et al., 1994; Pearson 1990), dan NetPrimer diperlukan dalam perancangan primer gen spesifik. Perancangan ini juga telah menghemat tenaga, uang, dan waktu daripada pekerjaan uji coba PCR 2.3 Persyaratan Primer yang baik Pemilihan primer yang akan digunakan pada PCR harus memenuhi kriteria atau parameter tertentu agar primer berfungsi maksimal, parameter tersebut diantaranya adalah : 1. Panjang primer 18-24 nukleotida, jika kurang dari 15 akan menurunkan spesifitas hibridisasi dengan DNA target, jika lebih dari 40 akan menurunkan aktivitas DNA polymerase 2. Suhu leleh (Tm) primer 50-600C dengan selisih Tm antara primer kurang dari 50C 3. Urutan nukleotid yang sama tidak boleh lebih dari 4 karena akan menurunkan spesifitasnya 4. Kandungan GC sebaiknya 40-60% 5. Ujung 3’ kedua primer tidak saling berkomplemen

BAB 3

METODE

3.1 Alat dan Bahan Alat : Komputer dan Koneksi Internet Bahan

: CDS gen dari organisme tertentu sebagai molekul DNA target

3.2 Cara Kerja 1. Mencari CDS gen target Membuka situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov

Ketikkan gen yang mau dicari sekuensnya pada kolom search

Pilih nucleotide pada pilihan all database

Tekan tombol search

Pilih complete genome

Klik FASTA

2. Mencari primer Membuka situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov

Klik DNA dan RNA

Klik Primer-BLAST

Salin semua CDS gen yang dimaksud pada kolom enter accession gi or FASTA sequence

Pilih genome (all organism) sebagai pilihan database

Klik Get Primer

Tunggu hingga hasilnya keluar

3. Menentukan Spesifitas Primer Membuka situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov

Pilih BLAST

Pilih nucleotide BLAST

Masukkan primer yang ingin dicek pada kolom enter accession number(s), gi(s), or FASTA sequence

Pilih nucletide pada pilihan database

Klik BLAST

Tunggu smpai hasilnya keluar

BAB 4

HASIL

4.1 Hasil Pengamatan 1. Mencari CDS gen target dari situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov a. Buka laman tersebut

b. Ketikkan gen yang mau dicari sekuens-nya pada kolom search. Pilih nucleotide pada pilihan all databases. Tekan tombol search

c. Memilih complete genome sebagai berikut

d. Klik Fasta akan muncul hasil sebagai berikut

2. Mencari primer a. Buka kembali situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov di tab yang berbeda

b. Klik DNA &RNA

c. Klik Primer-BLAST dengan hasil tampilan berikut

d. Salin semua CDS yang dimaksud pada kolom enter accesion gi or FASTA sequence. Pilih genome (all organisms) sebagai pilihan database. Lalu klik Get Primer

e. Hasil tampilan Get Primer

3. Menentukan spesifitas primer a. Buka kembali laman http://www.ncbi.nlm.nih.gov di tab yang berbeda

b. Tampilan dari memilih BLAST. Pilih Nucleotide BLAST

c. Tampilan dari Nucleotide BLAST

d. Memasukkan primer yang ingin dicetak pada kolom enter accesion number Primer 3

Primer 7

Primer 8

e. Hasil klik BLAST akan memperoleh presentase kesamaan dan nucleotide BLAST Primer 3

Primer 7

Primer 8

4. Hasil Primer No 3 7 8

Primer F R F R F R

TGTCAACCTGACCCTTCCAC AGGGTCTTGACCAGGGTTTG TGAAAGAAGAGCCCCAAGGT GGCAGTTGGCGTCATAGTTG TCGGCACCAAATCAGGAGAT GTTCTGCAGCACAATGTCCA

Panjang primer 20 20 20 20 20 20

Panjang produk 207 135 135

GC%

TM

Dimer

55,00 55,00 50,00 55,00 50,00 50,00

59,53 59,52 58,95 59,55 59,09 59,05

1-20 267-286 1-20 107-126 1-20 137-156

Hasil BLAST 100% 100% 100% 100% 100% 100%

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/primertool.cgi?ctg_time=1527324117&job_key=rKZzB6ReqfaOzDnJNKkd -06yDMljoRfUYg

BAB 5

PEMBAHASAN

5.1 Primer Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi (sekitar 95ºC). Salah satu enzim DNA polimerase yang umum digunakan adalah Taq DNA polimerase, yang berasal dari bakteri termofilik Thermus aquaticus. Tiap

putaran

templat, penempelan

reaksi primer,

PCR

terdiri

atas

dan polimerisasi

tiga

tahap,

yaitu denaturasi

yang

masing-masing

primer,

berlangsung pada suhu lebih kurang 95ºC, 50ºC, dan 70ºC. Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNA templat. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward primer) dan primer mundur (reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 5’ DNA templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5’ ke 3’ atau berarti dari ujung 3’ ke 5’ untai templatnya). Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA. Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2 n – 2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan

urutan

(diamplifikasi). 5.2 Primer dari gen IL6

target

yang

memang

dikehendaki

untuk

digandakan

Dari gen IL6 didapat sequence DNA yang kemudian dimasukkan kedalam sebuah kolom untuk mengetahui primer dari gen tersebut. Hasil penelusuran menunjukkan bahwa gen IL6 memiliki 10 primer yang berbeda. Dari kesepuluh primer tersebut dipilih primer yang paling baik dan yang memenuhi persyaratan primer yang baik. Pada praktikum kali ini primer yang dipilih adalah primer 3, primer 7, dan primer 8.

1. Primer 3 Forward primer “TGTCAACCTGACCCTTCCAC” Reverse primer “AGGGTCTTGACCAGGGTTTG” Forward primer dimulai pada panjang basa 267 bp dengan panjang primer forward 20 bp. Suhu annealing untuk primer ini adalah 59.53°C dengan konsentrasi GC 55%. Primer ini memiliki struktur Self complementarity. Query

1

GACAAAACCACAGGCGAACC

20

||||||||||||||||||||

Sbjct

267

TGTCAACCTGACCCTTCCAC

286

Reverse primer dimulai pada panjang basa 473 bp dengan panjang primer reverse 20 bp. Suhu annealing untuk primer ini adalah 59.52°C dengan konsentrasi GC 55%. Primer ini memiliki struktur Self complementarity dan Self 3' complementarity. Primer 3 ini memilki panjang produk 207 nukleotida. 1. Primer 7 Forward primer “TGAAAGAAGAGCCCCAAGGT” Reverse primer “GGCAGTTGGCGTCATAGTTG” Forward primer dimulai pada panjang basa 107 bp dengan panjang primer forward 20 bp. Suhu annealing dari primer ini adalah 58,85°C dengan konsentrasi GC 55%. Primer ini memiliki struktur Self complementarity dan Self 3' complementarity. Query

1

TGAAAGAAGAGCCCCAAGGT

20

|||||||||||||||||||| Sbjct

107

TGAAAGAAGAGCCCCAAGGT

126

Reverse primer dimulai pada panjang basa 241 bp dengan panjang primer reverse 20 bp. Suhu annealing dari primer ini adalah 59.55°C dengan konsentrasi GC 55%. Primer ini memiliki struktur Self complementarity dan Self 3' complementarity. Primer 7 ini memiliki panjang produk 135 nukleotida. 2. Primer 8 Forward primer “TCGGCACCAAATCAGGAGAT” Reverse primer “GTTCTGCAGCACAATGTCCA” Forward primer dimulai pada panjang basa 316 bp dengan panjang primer forward 20 bp. Suhu annealing dari primer ini adalah 59.09°C dengan konsentrasi GC 55%. Primer ini memiliki sturktur Self complementarity dan Self 3' complementarity. Query

1

TCGGCACCAAATCAGGAGAT

20

|||||||||||||||||||| Sbjct

316

TCGGCACCAAATCAGGAGAT

335

Reverse primer dimulai pada panjang basa 450 bp dengan panjang primer reverse 20 bp. Suhu annealing dari primer ini adalah 59.05°C dengan konsentrsi GC 50%. Primer ini memiliki struktur self complementarity dan self 3’ complementarity. Primer 3 ini memiliki panjang produk 135 nukleotida.

BAB 6

PENUTUP

6.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilakukan dapat diketahui jika ketiga primer diatas memenuhi persyaratan sebagai primer yang baik. Ketiga primer diatas memiliki panjang primer 20 nukleotida (syaratnya harus dalam rentang 18-24 nukleotida), suhu leleh primernya 59.97°C (syaratnya 50-60°C) dan selisih Tm antar primer kurang dari 5. Setelah ditentukan primer yang baik maka selanjutnya perlu dilakukan pengujian dari keiga primer tersebut. Pengujiannya adalah apakah primer tersebut memiliki spesifitas yang abaik atau tidak. Spesifitas adalah kemampuan alat tes untuk mendeteksi mereka yang memiliki kesamaan nukleotida dengan DNA target. Primer yang telah kita desain tersebut harus diuji spesifisitasnya agar kita yakin bahwa: 

Primer tersebut hanya akan mengamplifikasi daerah yang kita mau



Tidak menempel pada daerah lain di genom organisme target (dalam contoh ini TMV memiliki materi genetik berupa RNA)



Tidak menempel pada DNA organisme lain yang mungkin tercampur bersama DNA TMV ketika isolasi DNA. Misalnya DNA host-nya TMV yaitu tembakau. Dari hasil penngujian spesifitas menggunakan aplikasi BLAST didapat data bahwa spesifitas primer adalah 100%. Artinya, primer yang kita pilih memiliki kesamaan dengan DNA target sebesar 100%.

6.2 Saran Pada praktikum kali ini harus benar-benar teliti dalam memilih complete genome agar dapat menghasilkan data nukleotida dan protein yang baik.

DAFTAR PUSTAKA

Breslauer, K.J., Frank, R., Blocker, H., Markey, L.A. 1986. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 3746-3750. Dieffenbach, C.W. and Dveksler, G.S. 1995. PCR Primer, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Freier, S.M., Kierzek, R., Jaeger, J.A., Sugimoto, N., Caruthers, M.H., Neilson, T., and Turner, D.H. 1986. Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex stability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9373-9377. Gordon, A.J., Minchin, F.R., James, C.L., and Komina, O. 1999. Sucrose synthase in legume nodules is essential for nitrogen fixation. Plant Physiol.,120, 867878. Higgins, D.G., Thompson, J.D., and Gibson, T.J. 1994. Clustal W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acid Res., 22, 4673-4680. Pearson, W.R. 1990. Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP dan FASTA. Methods Enzymology, 183, 63-98. Rychlik, W. 1995. Selection of primers for polymerase chain reaction. Molecular Biotechnology, 3, 129-134.