309454673-estudio-de-algunos-factores-que-afectan-el-establecimiento-de-un-metodo-espectrofotometrico.docx
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SISTEMAS DE CONTROL DE CALIDAD
PROFESORES: M en C Aura Hernández Olicón M en C Mónica Rivera Rosas QBP Cinthya Salimah Martínez Reyes ALUMNO: Valdes Ortiz Alvaro A. PRÁCTICA: MATERIAL DE CALIBRACIÓN Y MATERIAL PARA CONTROL DE CALIDAD GRUPO: 5QV2 SECCIÓN: 3 EQUIPO: 2 FECHA DE ENTREGA 17/04/2018
INTRODUCCIÓN Existen varios métodos para determinar un mesurado de interés. En el argot de la química se utilizan dos métodos: el método definitivo y el método de referencia .Se considera que el método definitivo es de difícil accesibilidad, debido a que utiliza metodologías caras en cuanto a equipos y reactivos y con frecuencia requiere de analistas especializados .Por ello, en la determinación analítica rutinaria de un mensurado se utilizan metodologías de mayor accesibilidad de reactivos y equipos, además de ser fáciles de realizar por el analista, sin embargo, antes de ser utilizadas se deben de comparar con el método de referencia, el cual se considera de bastante exactitud. En el laboratorio, es de interés evitar desviaciones analíticas al determinar un mensurado; para asegurar los resultados es necesario verificar el buen funcionamiento de los métodos, realizando la calibración del método analítico con el uso de especímenes de una sustancia de concentración conocida, relacionado de forma matemática la lectura analítica con el valor nominal de la sustancia que se mide .Asimismo, la preparación de los materiales de calibración debe hacerse con el mayor cuidado posible, ya que la exactitud del calibrador afecta directamente a la exactitud de los resultados. Para la realización de una metodología química, se requiere de materiales primarios que son utilizados para la preparación de estándares a partir de los cuales se pueden preparar soluciones de concentraciones conocidas llamadas calibradores (estándar de calibración) que contengan una cantidad conocida del componente que se analiza, los cuales se utilizan en todas las medidas cuantitativas.
OBJETIVOS
Realizar una corrida analítica completa para la determinación de un mensurado de interés controlando el proceso analítico y la calidad de los resultados, a través de comprender la diferencia entre calibradores y controles. Establecer la importancia del uso de los calibradores y controles para validar y vigilar el proceso analítico.
FUNDAMENTO Los materiales de control se utilizan para la comparación de métodos, sin embrago, se verán afectados por la manipulación en el laboratorio incluyendo; estabilidad del material reconstruido, variación de uno a otro frasco, valores asignados incorrectos, por lo que se debe de controlar el proceso de reconstrucción siguiendo las instrucciones del producto, utilizando buenas tácticas de pipeteo, agua o diluyente de excelente calidad, tiempo óptimo de reconstitución y forma de conservación antes de su empleo y eliminación de contaminación por bacterias.
MÉTODO Determinación de glucosa sérica por el método de glucosa oxidasa. 1
INICIO
Colocar 1 mL de glucosa oxidasa a 10 tubos
Adicionar 10µL de los estándares, uno por cada tubo
Ajustar a cero de absorbancia con blanco de glucosa oxidasa 50, 100, 200, 300, 400 y 700 mg/dL
Determinar la concentración de los controles y la muestra
Adicionar en un tubo 10 µL de muestra en un tubo del paso 1
FIN
Homogenizar los tubos
1
Registrar las absorbancias
Construir la curva tipo correspondiente
Adicionar 10 µL de C2 en un tubo y 10 µL de C3 en otro tubo, que fueron preparados en el paso 1
Incubar los tubos
Realizar las lecturas en el espectrofotómetro a 510 nm
A 37°C por 10 min. o A 20°C por 25 min.
RESULTADOS BITÁCORA DE RESULTADOS FECHA: 10 de abril de 2018 Material de calibración y material para control de calidad Resultados y observaciones Corrida analítica Determinación de: Glucosa sérica Método: Glucosa oxidasa Unidades: mg/dl Blanco utilizado: Solución de glucosa oxidasa λ seleccionada: 510 nm Datos del estándar: Estándar utilizado: Estándar de glucosa
Estándar
Concentración del estándar (mg/dL)
1 2 3 4 5 6 7
25 50 100 200 300 400 700
Absorbancia obtenida
Concentración del estándar calculada (mg/dL)
%error
Datos del suero control: Suero control Normal Patológico alto
Conc. del suero mg/dL
Intervalos mg/dL 96-132 240-322
Suero control utilizado: Normal (2) y patológico alto (3).
Absorbancia obtenida
Datos de las muestras: Conc. Obtenida de la muestra Muestra problema
Absorbancia
Curva tipo mg/dL
Ecuación de la recta mg/dL
Conc. Real de la muestra mg/dL
Factor mg/dL
M2 Características de la muestra: se observó que el suero presentaba una coloración muy amarillenta y presentaba pequeños sólidos en la superficie. Factor utilizado:
ABSORBANCIA A 500 nm
2
y = 0.0028x + 0.1239 R = 0.9857
1.8 1.6
1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
100
200
300
400
500
600
700
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (mg/dL) Figura 1. Curva tipo para la determinación de la concentración de glucosa sérica por el método de glucosa oxidasa en un intervalo de concentraciones de 25 a 700 mg/dL.
ABSORBANCIA A 500 nm
1.4
y = 0.0035x + 0.0253 R = 0.9997
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
50
100
150
200
250
300
350
400
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (mg/dL) Figura 2. Curva tipo para la determinación de la concentración de glucosa sérica por el método de glucosa oxidasa en un intervalo de concentraciones de 25 a 400 mg/dL.
ABSORBANCIA A 500 nm
2
y = 0.0027x + 0.1576 R = 0.9837
1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
100
200
300
400
500
600
700
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (mg/dL) Figura 3. Curva tipo para la determinación de la concentración de glucosa sérica por el método de glucosa oxidasa en un intervalo de concentraciones de 50 a 700 mg/dL.
ABSORBANCIA A 500 nm
1.4
y = 0.0035x + 0.0218 R = 0.9996
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
50
100
150
200
250
300
350
400
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (mg/dL) Figura 4. Curva tipo para la determinación de la concentración de glucosa sérica por el método de glucosa oxidasa en un intervalo de concentraciones de 50 a 400 mg/dL.
CONCENTRACIÓN CALCULADA (mg/dL)
500.00
y = 0.9342x + 5.8599 R = 0.9996
400.00 300.00 200.00 100.00 0.00 0
100
200
300
400
500
600
CONCENTRACIÓN (mg/dL) Figura 5. Verificación de la linealidad.
700
DISCUSIÓN La mejor curva tipo obtenida fue la que va de 50 a 400 mg/dL, lo cual coincide con las indicaciones de linealidad que proporciona el fabricante de la glucosa oxidasa. Una vez construyendo la gráfica de concentración por concentración calculada, se puede notar que la curva no es lineal, por lo tanto no sigue a la ley de Bouger-Beer. Esto a su vez no permite conocer con exactitud la concentración de los controles ni de la muestra, es por esto que los controles no están dentro de los intervalos indicados por el fabricante y por lo tanto el resultado no se valida. Los porcientos de error nos indican que existe un error de tipo sistemático, este puede deberse a que el analista no tomo las alícuotas de forma correcta o bien que las celdas donde se tomaron las lecturas, se encontraran con residuos de sales o contaminantes que pudieran interferir en las lecturas. También se debe tomar en cuenta que el reactivo se encontraba caduco, lo cual limitaría la actividad de la enzima glucosa oxidasa, y así proporcionar datos no confiables. CONCLUSIONES
La curva tipo se debe repetir ya que no sigue la ley de Bouger-Beer. No se puede reportar el resultado, ya que los controles no se encuentran dentro del intervalo y por lo tanto no se valida el resultado.
PREGUNTAS EXTRA Fundamento del método de la glucosa oxidasa La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico. El peróxido de hidrógeno (H2O2), producido se detecta mediante un aceptor cromogénico de oxígeno, fenol-ampirona en presencia de peroxidasa (POD): GOD
β-D-Glucosa + O2 + H2O → Ácido glucónico + H2O2 POD
H2O2 + Fenol + Ampirona → Quinona + H2O
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra ensayada.
Valores de referencia de glucosa sérica en México Metas del tratamiento
Bueno
Regular
Malo
Glucemia en ayunas (mg/dl)
<110
110-140
>140
Glucemia postprandial de 2 h. (mg/dl)
<140
<200
>240
REFERENCIAS
Arderiu Fuentes X., Lacambra Castiñeiras M. J., Compaño Queralto M. J., Bioquímica clínica y patología molecular, Vol. I., Ed. Reverte, ed. 2 a, Barcelona, 1998. NOM-015-SSA2-1994 http://www.spinreact.com.mx/public/_pdf/1001190.pdf http://www.cenam.mx/materiales/defyusos.aspx#Usos_de_los_materiales_de_ref erencia
PROFESORES: M en C Aura Hernández Olicón M en C Mónica Rivera Rosas QBP Cinthya Salimah Martínez Reyes ALUMNO: Valdes Ortiz Alvaro A. PRÁCTICA: MATERIAL DE CALIBRACIÓN Y MATERIAL PARA CONTROL DE CALIDAD GRUPO: 5QV2 SECCIÓN: 3 EQUIPO: 2 FECHA DE ENTREGA 17/04/2018
INTRODUCCIÓN Existen varios métodos para determinar un mesurado de interés. En el argot de la química se utilizan dos métodos: el método definitivo y el método de referencia .Se considera que el método definitivo es de difícil accesibilidad, debido a que utiliza metodologías caras en cuanto a equipos y reactivos y con frecuencia requiere de analistas especializados .Por ello, en la determinación analítica rutinaria de un mensurado se utilizan metodologías de mayor accesibilidad de reactivos y equipos, además de ser fáciles de realizar por el analista, sin embargo, antes de ser utilizadas se deben de comparar con el método de referencia, el cual se considera de bastante exactitud. En el laboratorio, es de interés evitar desviaciones analíticas al determinar un mensurado; para asegurar los resultados es necesario verificar el buen funcionamiento de los métodos, realizando la calibración del método analítico con el uso de especímenes de una sustancia de concentración conocida, relacionado de forma matemática la lectura analítica con el valor nominal de la sustancia que se mide .Asimismo, la preparación de los materiales de calibración debe hacerse con el mayor cuidado posible, ya que la exactitud del calibrador afecta directamente a la exactitud de los resultados. Para la realización de una metodología química, se requiere de materiales primarios que son utilizados para la preparación de estándares a partir de los cuales se pueden preparar soluciones de concentraciones conocidas llamadas calibradores (estándar de calibración) que contengan una cantidad conocida del componente que se analiza, los cuales se utilizan en todas las medidas cuantitativas.
OBJETIVOS
Realizar una corrida analítica completa para la determinación de un mensurado de interés controlando el proceso analítico y la calidad de los resultados, a través de comprender la diferencia entre calibradores y controles. Establecer la importancia del uso de los calibradores y controles para validar y vigilar el proceso analítico.
FUNDAMENTO Los materiales de control se utilizan para la comparación de métodos, sin embrago, se verán afectados por la manipulación en el laboratorio incluyendo; estabilidad del material reconstruido, variación de uno a otro frasco, valores asignados incorrectos, por lo que se debe de controlar el proceso de reconstrucción siguiendo las instrucciones del producto, utilizando buenas tácticas de pipeteo, agua o diluyente de excelente calidad, tiempo óptimo de reconstitución y forma de conservación antes de su empleo y eliminación de contaminación por bacterias.
MÉTODO Determinación de glucosa sérica por el método de glucosa oxidasa. 1
INICIO
Colocar 1 mL de glucosa oxidasa a 10 tubos
Adicionar 10µL de los estándares, uno por cada tubo
Ajustar a cero de absorbancia con blanco de glucosa oxidasa 50, 100, 200, 300, 400 y 700 mg/dL
Determinar la concentración de los controles y la muestra
Adicionar en un tubo 10 µL de muestra en un tubo del paso 1
FIN
Homogenizar los tubos
1
Registrar las absorbancias
Construir la curva tipo correspondiente
Adicionar 10 µL de C2 en un tubo y 10 µL de C3 en otro tubo, que fueron preparados en el paso 1
Incubar los tubos
Realizar las lecturas en el espectrofotómetro a 510 nm
A 37°C por 10 min. o A 20°C por 25 min.
RESULTADOS BITÁCORA DE RESULTADOS FECHA: 10 de abril de 2018 Material de calibración y material para control de calidad Resultados y observaciones Corrida analítica Determinación de: Glucosa sérica Método: Glucosa oxidasa Unidades: mg/dl Blanco utilizado: Solución de glucosa oxidasa λ seleccionada: 510 nm Datos del estándar: Estándar utilizado: Estándar de glucosa
Estándar
Concentración del estándar (mg/dL)
1 2 3 4 5 6 7
25 50 100 200 300 400 700
Absorbancia obtenida
Concentración del estándar calculada (mg/dL)
%error
Datos del suero control: Suero control Normal Patológico alto
Conc. del suero mg/dL
Intervalos mg/dL 96-132 240-322
Suero control utilizado: Normal (2) y patológico alto (3).
Absorbancia obtenida
Datos de las muestras: Conc. Obtenida de la muestra Muestra problema
Absorbancia
Curva tipo mg/dL
Ecuación de la recta mg/dL
Conc. Real de la muestra mg/dL
Factor mg/dL
M2 Características de la muestra: se observó que el suero presentaba una coloración muy amarillenta y presentaba pequeños sólidos en la superficie. Factor utilizado:
ABSORBANCIA A 500 nm
2
y = 0.0028x + 0.1239 R = 0.9857
1.8 1.6
1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
100
200
300
400
500
600
700
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (mg/dL) Figura 1. Curva tipo para la determinación de la concentración de glucosa sérica por el método de glucosa oxidasa en un intervalo de concentraciones de 25 a 700 mg/dL.
ABSORBANCIA A 500 nm
1.4
y = 0.0035x + 0.0253 R = 0.9997
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
50
100
150
200
250
300
350
400
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (mg/dL) Figura 2. Curva tipo para la determinación de la concentración de glucosa sérica por el método de glucosa oxidasa en un intervalo de concentraciones de 25 a 400 mg/dL.
ABSORBANCIA A 500 nm
2
y = 0.0027x + 0.1576 R = 0.9837
1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
100
200
300
400
500
600
700
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (mg/dL) Figura 3. Curva tipo para la determinación de la concentración de glucosa sérica por el método de glucosa oxidasa en un intervalo de concentraciones de 50 a 700 mg/dL.
ABSORBANCIA A 500 nm
1.4
y = 0.0035x + 0.0218 R = 0.9996
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
50
100
150
200
250
300
350
400
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (mg/dL) Figura 4. Curva tipo para la determinación de la concentración de glucosa sérica por el método de glucosa oxidasa en un intervalo de concentraciones de 50 a 400 mg/dL.
CONCENTRACIÓN CALCULADA (mg/dL)
500.00
y = 0.9342x + 5.8599 R = 0.9996
400.00 300.00 200.00 100.00 0.00 0
100
200
300
400
500
600
CONCENTRACIÓN (mg/dL) Figura 5. Verificación de la linealidad.
700
DISCUSIÓN La mejor curva tipo obtenida fue la que va de 50 a 400 mg/dL, lo cual coincide con las indicaciones de linealidad que proporciona el fabricante de la glucosa oxidasa. Una vez construyendo la gráfica de concentración por concentración calculada, se puede notar que la curva no es lineal, por lo tanto no sigue a la ley de Bouger-Beer. Esto a su vez no permite conocer con exactitud la concentración de los controles ni de la muestra, es por esto que los controles no están dentro de los intervalos indicados por el fabricante y por lo tanto el resultado no se valida. Los porcientos de error nos indican que existe un error de tipo sistemático, este puede deberse a que el analista no tomo las alícuotas de forma correcta o bien que las celdas donde se tomaron las lecturas, se encontraran con residuos de sales o contaminantes que pudieran interferir en las lecturas. También se debe tomar en cuenta que el reactivo se encontraba caduco, lo cual limitaría la actividad de la enzima glucosa oxidasa, y así proporcionar datos no confiables. CONCLUSIONES
La curva tipo se debe repetir ya que no sigue la ley de Bouger-Beer. No se puede reportar el resultado, ya que los controles no se encuentran dentro del intervalo y por lo tanto no se valida el resultado.
PREGUNTAS EXTRA Fundamento del método de la glucosa oxidasa La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico. El peróxido de hidrógeno (H2O2), producido se detecta mediante un aceptor cromogénico de oxígeno, fenol-ampirona en presencia de peroxidasa (POD): GOD
β-D-Glucosa + O2 + H2O → Ácido glucónico + H2O2 POD
H2O2 + Fenol + Ampirona → Quinona + H2O
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra ensayada.
Valores de referencia de glucosa sérica en México Metas del tratamiento
Bueno
Regular
Malo
Glucemia en ayunas (mg/dl)
<110
110-140
>140
Glucemia postprandial de 2 h. (mg/dl)
<140
<200
>240
REFERENCIAS
Arderiu Fuentes X., Lacambra Castiñeiras M. J., Compaño Queralto M. J., Bioquímica clínica y patología molecular, Vol. I., Ed. Reverte, ed. 2 a, Barcelona, 1998. NOM-015-SSA2-1994 http://www.spinreact.com.mx/public/_pdf/1001190.pdf http://www.cenam.mx/materiales/defyusos.aspx#Usos_de_los_materiales_de_ref erencia
