3.- Estudio Microscopico De Los Microorganismos

PRÁCTICA # 3 “ESTUDIO MICROSCÓPICO DE LOS MICROORGANISMOS” INTRODUCCIÓN: Una de las características más importantes de los microorganismos es su tamaño minúsculo que los hace imperceptibles a simple vista y, aunado a su transparencia, obliga a utilizar (además del microscopio) técnicas especiales para observar y estudiar su morfología y algunas de sus estructuras. Desde Leewenhoek, los pioneros de la microbiología los observaban en gotas de algún fluido, pero el escaso contraste con el medio y el continuo movimiento impedían el estudio detallado o prolongado de los microorganismos. Koch fue el primero en “fijar” las preparaciones y teñirlas como había hecho Weigert en histología. Hoy en día se dispone de una amplia variedad de tinciones microbiológicas que constituyen herramientas muy importantes para la detección, identificación y control de los microorganismos, que van desde técnicas sencillas y rutinarias, hasta tinciones altamente sofisticadas para el diagnóstico y la investigación.

OBJETIVOS: Mediante esta practica, el alumno lograra: ℘ Realizar adecuadamente las preparaciones y tinciones más utilizadas para el estudio microscópico de los microorganismos. ℘ Identificar y describir correctamente las características morfológicas y de locomoción de algas y protozoarios.

℘

Identificar y describir correctamente las características microscópicas y tintoriales de las bacterias, tales como forma, agrupación, cápsulas y si son Grampositivas o gramnegativas.

REPORTE: Tipos de preparaciones: Preparaciones en fresco: La forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico es hacer una preparación en fresco. Existen dos técnicas, una preparación en fresco simple que consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un portaobjetos y a continuación cubrirla con un cubreobjetos. Una preparación en gota pendiente; esta preparación se realiza colocando una gota de la suspensión bacteriana en un cubreobjetos en el cual se ha hecho previamente un círculo con vaselina (actúa como sellador) o parafina; sobre el cubreobjetos se coloca un portaobjetos con una excavación central que queda adherido gracias a la vaselina. Se invierte la preparación y se observa colocándola en la platina del microscopio. La ventaja de esta última técnica, es que la preparación no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo. Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos y observar: la movilidad, el tamaño y la forma de agrupación de los microorganismos en su estado natural y sin alteraciones; así como gránulos refráctiles, esporas si teñir y cloroplastos dentro de las células vivas. Sin embargo, el inconveniente de la observación en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparación por la escasa diferencia entre los índices de refracción del medio y de los microorganismos; por otra parte, el movimiento continuo de los microorganismos, así como el causado por las corrientes de fluido, frecuentemente hacen difícil la observación. Por tanto, su uso, con un microscopio óptico de campo claro, está bastante limitado. A este tipo de preparaciones se pueden agregar colorantes muy diluidos como el cristal violeta, rojo neutro, verde Janus, que aumentan el contraste de las células sin afectar su viabilidad. Preparaciones fijas y teñidas: La preparación consiste en una capa de la muestra extendida sobre un portaobjetos libre de grasa. Esta preparación debe ser lo suficientemente delgada para permitir el paso de la luz a través de ella. El “extendido” o “frote” se puede hacer de varias maneras:

°

Suspendiendo el desarrollo microbiano en una pequeña gota de agua mediante el asa y distribuyéndolo en el portaobjetos.

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° ° ° °

Por “impronta”, presionando el porta sobre la muestra. Con cinta adhesiva transparente Con hisopo Colocando una gota de la muestra fluida en el porta.

Los extendidos o frotes se dejan secar al aíre; para asegurar que las células queden adheridas al portaobjetos y no se desprendan durante los lavados que se realizan durante la tinción; la preparación se fija con calor moderado, pasando el portaobjetos 5 o 6 veces sobre la flama del mechero, o adicionando sustancias deshidratantes y/o precipitantes como metanol o cloruro mercúrico, procediendo a hacer la tinción. Esta puede ser:

Positiva:

Cuando se colorea directamente a los microorganismos o a las estructuras en estudio; utilizan colorantes. Negativa: Cuando se oscurece el fondo de la preparación y se observa la silueta incolora de los microorganismos. Colorantes: Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste; son compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les confieren color. Están formados por un grupo cromóforo, que en la parte de la molécula responsable del color y un grupo auxócromo que, al formar sales, les permite disociarse y combinarse. Existen algunos, llamados colorantes vitales, que pueden añadirse directamente a una preparación en fresco; por tanto, colorean células vivas. No obstante, la mayoría de los colorantes son solamente efectivos después de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, se encuentren muertos y adheridos al portaobjetos. Para la fijación por calor, se realiza una fina extensión de una gota de muestra líquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a continuación, se pasa la preparación de Forma rápida sobre la llama de un mechero; El calor de la llama mata las células microbianas por desnaturalización de sus proteínas. Las proteínas coaguladas unen las células al porta. Cuando se desea fijar especimenes delicados se utiliza la fijación química, que es menos agresiva que el calor. Para ello se añade una gota del fijador, por ejemplo, ácido ósmico, formaldehído, o glutaraldehído, sobre la muestra líquida con los microorganismos. La fijación posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona la apariencia real de las células, lo cual dificulta la identificación; además, no permite la observación del movimiento de los microorganismos. Después de la fijación, se añade el colorante, que debe permanecer el tiempo suficiente en contacto con el espécimen, para que pueda ser absorbido. A continuación, se retira el exceso de colorante, normalmente lavando con agua. Tipos de colorantes Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados. Los colorantes básicos son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el ion cargado positivamente (el cromóforo) y se combinan con los componentes ácidos de la célula como ADN y ARN, mientras que en los ácidos, el colorante es el ion cargado negativamente y se combinan con los componentes básicos de la célula, como el citoplasma; es decir se combinan con los componentes celulares en función de sus respectivas cargas; por lo tanto, los factores como fuerza iónica, composición del medio, temperatura y pH afectan las tinciones. Los colorantes más utilizados son los de tipo básico, ya que la mayor parte de las células microbianas poseen cargas débilmente negativas en su superficie, lo cual facilita su unión. Entre los colorantes básicos más comunes se encuentran la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta y el azul de metileno. Los colorantes ácidos se unen a las partes de las células cargadas positivamente. Se utilizan para teñir tejidos animales infectados con microorganismos. Entre los más frecuentes están la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen gran importancia en algunas técnicas de tinción. Los mordientes intensifican la tinción porque aumentan la afinidad de la célula por el colorante. Se usa cuando la afinidad química entre el componente celular y el colorante es baja; también se pueden utilizar para producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que debido a su delgadez no podrían ser visualizados de otra forma. Finalmente, algunos colorantes precipitan o se disuelven en componentes celulares tales como el negro de Sudán, que es liposoluble y permite distinguir los glóbulos de grasa. Tipos de tinciones: Pueden agruparse en: tinciones simples, diferenciales y selectivas.

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TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA BACTERIAS Tinción Tinciones simples

Uso

Técnicas

Un colorante; proporciona contraste para observar mejor un organismo completo

Se tiñe con un colorante básico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina básica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tiñen casi todas las bacterias; la rnayoría de los tejidos no se tiñen.

Tinciones diferenciales Tinción de Gram.

Dos o más colorantes; distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativas

Se cubre la preparación de bacterias fijadas con cristal violeta y después con una solución de iodo (mordiente). Todas las células quedan tenidas de color violeta oscuro. Se decolora con acetona al 95%. Las células Gram positivas permanecen tenidas, pero las negativas pierden el colorante. Se tiñe con safranina (contraste). El color violeta de las Gram positivas se vuelve más oscuro y las Gram negativas se tiñen de rosa.

Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen)

Dos colorantes; distingue entre las micobacterias (ácido-alcohol resistentes) y el resto de las bacterias

Se tiñen las células con fucsina básica y se calienta a emisión de vapores durante 5 minutos. Todas las bacterias se tiñen de rojo. Se decolora brevemente con una mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias resistentes permanecen teñidas de rojo; todas las demás se decoloran. Se trata con el colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias ácidoalcohol resistentes continúan tenidas de rojo, las otras se tiñen de azul.

Tinciones selectivas Tinción de esporas de Wirtz-Cortitlin

Tiñe selectivamente las Se cubre la preparación con verde de malaquita y se endosporas calienta a emisión de vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tiñe con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de la célula toma el color rosa.

Tinción de flagelos de Leifson

Permite flagelos

Tinción negativa

Revela la presencia de Se utiliza tinta china o nigrosina para teñir una preparación cápsulas en fresco del espécimen. Las partículas de colorante no pueden penetrar en la cápsula, que se observa como una región clara alrededor de la célula.

observar

los A las células previamente fijadas, se le añade una mezcla de ácido tánico (mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el colorante los fine.

1) Tinciones simples En las tinciones simples se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico como safranina, azul de metileno o cristal violeta. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple mejora la observación de la célula completa. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente, hay que añadirlo justo antes del colorante. 2) Tinciones diferenciales Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta de dos etapas: una tinción primaria (siguiendo el mismo método que en una tinción simple) seguida de una tinción de contraste. En la tinción de contraste se utiliza otro colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas por el primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiología. Por ejemplo, la tinción de Gram y la tinción de ácido-alcohol resistencia, ambas aplicadas a bacterias. a) Tinción de Gram

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Método de identificación de bacterias mediante una tinción específica. Desarrollado por el médico danés Hans Christian Joachim Gram en 1884. Esta tinción clasifica las bacterias en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas. Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tinción azul y bacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas. Algunas bacterias presentan capacidad variable de tinción de Gram y se llaman Gram variables. Bacterias Gram positivas típicas son los estafilococos que producen forúnculos; Gram negativas representativas son la Escherichia coli de la flora intestinal o los bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos de Koch de la tuberculosis. La técnica incluye tinción primaria, decoloración y tinción de contraste: En un primer momento las bacterias se tiñen con violeta de genciana (derivado metilado anilínico) y después se tratan con la solución de Gram (1 parte de yodo, 2 partes de yoduro potásico y 300 partes de agua); por último se lavan con alcohol etílico, o acetona y unas bacterias retienen el fuerte color azul de la violeta de genciana y otras se decoloran por completo (en este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tinción violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante). A veces se añade una contratinción con fucsina o eosina para teñir las bacterias decoloradas de color rojo y hacerlas más visibles que tiñe de rosa las bacterias Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les proporciona un color violeta más intenso. El distinto comportamiento frente a los colorantes de las bacterias Gram positivas y Gram negativas se debe a las diferencias existentes en sus superficies externas. Las células Gram negativas poseen una capa de peptidoglicano delgada y una membrana externa. Las bacterias Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicano v carecen de membrana externa. b) Tinción de Ziel-Neelsen o para Bacilos Ácido Alcohol resistentes (BAAR) La tinción diferencial de ácido-alcohol resistencia fue desarrollada por Paul Ehrlich en 1 882. Actualmente se utiliza una modificación de la técnica de Ehrlich que recibe el nombre de tinción de Ziehl-Neelsen. Esta tinción sirve para teñir bacterias del género Mycobacterium, el resto de las bacterias se tiñen de azul por el colorante de contraste. M. tuberculosis, causante de la tuberculosis y M leprae, causante de la lepra o enfermedad de Hansen, se identifican mediante esta tinción. Las micobacterias son ácido-alcohol resistentes porque poseen en sus cubiertas lípidos de ácidos grasos complejos que forman en su pared celular un material de tipo céreo resistente a la decoloración. Una tinción ácido-alcohol resistente se realiza según los siguientes pasos: ° Tinción primaria con fucsina básica, que tiñe todas las células de rojo. ° Calentamiento suave de la preparación para facilitar la penetración del colorante en el interior de la célula.

° °

Decoloración con una solución de ácido clorhídrico en etanol. Este decolorante elimina la fucsina de todas las células excepto de las micobacterias, que la retienen debido a su superficie cérea. Coloración de contraste con azul de metileno. Se tiñen de azul todas las células previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciación entre las células de Mycobacterum, aún teñidas de rojo, y las células restantes del espécimen.

Las micobacterias permanecen teñidas de rojo, mientras que el resto de las bacterias toman el color azul del colorante de contraste. 3) Tinciones específicas Mientras las tinciones diferenciales permiten distinguir entre distintos tipos de microorganismos, las tinciones específicas incrementan el contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen las endosporas, los flagelos y las cápsulas. *La tinción de esporas de Wirtz-Conklin: Algunas bacterias poseen endosporas, estructuras de resistencia que les permiten sobrevivir en condiciones ambientales extremas. Las endosporas poseen cubiertas gruesas e impermeables que no absorben la mayoría de los colorantes. La tinción de esporas de WirtzConklin, sin embargo, es efectiva. Forma de tinción: ° Tinción con verde de malaquita. ° Calentamiento a emisión de vapores durante tres a seis minutos, para que el colorante penetre a través de las paredes de la endospora. ° Lavado con agua del grifo, que elimina el colorante verde de todas las partes de la célula, con excepción de las esporas. ° Tinción de contraste con el colorante rosa safranina.

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Al final del proceso, las endosporas bacterianas quedan teñidas de verde y el resto de la célula (de rosa) Las bacterias Bacillus anthracis y Clostridium perfringens, agentes etiológicos del carbunco y la gangrena, respectivamente, forman esporas y pueden ser identificadas mediante esta tinción. *La tinción de flagelos de Leifson: Los flagelos son largos y finos apéndices de las células bacterianas que les permiten moverse, son tan delgados que resultan invisibles al microscopio óptico, si no se realiza una técnica especial para su tinción. Los distintos métodos de tinción utilizan combinaciones de mordientes y metales para engrosar los flagelos, así como colorantes para teñirlos. La tinción de flagelos de Leifson se realiza según la siguiente técnica: ° Se fija químicamente la suspensión bacteriana, mediante formol, y se hace la extensión en un portaobjetos. ° Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno. ° Se cubre la preparación con una mezcla de ácido tánico y el colorante rosanilina, de preparación extemporánea. El ácido tánico engruesa los flagelos y la rosanilina los tiñe.

°

Se retira el exceso de colorante con agua. ° Por último, se deja secar al aire, antes de su observación al microscopio. Esta tinción permite determinar el número y la disposición de los flagelos de las bacterias, lo que constituye una información esencial para la identificación de muchas especies. La tinción de flagelos es un arte que se adquiere sólo con la práctica. *Tinción negativa: Algunas bacterias están rodeadas por una estructura protectora denominada cápsula. Para poner de manifiesto la presencia de una cápsula se utiliza una técnica denominada tinción negativa: ° Se hace una preparación en fresco del espécimen. ° Se añade tinta china. Las partículas de carbón de la tinta no pueden penetrar en la cápsula, de manera que solo se ennegrece el fondo.

° °

Al microscopio, se observan las células y sus capsulas, como zonas claras alrededor de las mismas. Se puede aplicar un colorante para hacer las células más visibles (los colorantes habituales no tiñen las cápsulas). También se puede usar nigrosina, en lugar de tinta china.

*Tinción de núcleo de Feulgen o Giemsa-HCl: Los cromosomas se puede teñir por estas técnicas. En este caso, el HCl reduce la afinidad del citoplasma, especialmente la del ARN, por el colorante y aumenta la afinidad del núcleo por el mismo, de modo que el núcleo por el mismo, de modo que el núcleo se observa bien teñido dentro de un citoplasma de coloración clara. Para observar el núcleo de microorganismos eucariontes también se puede utilizar una solución muy diluida de azul de metileno, que tiene afinidad por los ácidos nucleicos combinándose con HgCl2 que precipita las proteínas asociadas al ADN lo que determina que se coloreen más intensamente que el resto de la célula; esta preparación no debe fijare a la flama, pues precipitarían todas las proteínas.

MATERIAL: ° Microscopio ° ° ° ° ° ° ° ° °

Mechero Asa y portasa Portaobjetos excavador y normales Cubreobjetos Palillos Pipetas pasteur Vaselina Muestras de pulque, agua de lago cultivos de microorganismos proporcionados por el profesor

°

Colorantes: safranina, azul de metileno, cristal violeta, solución de Gram., lugol, alcohol, acetona, nigrosina

PROCEDIMIENTOS y RESULTADOS: Elaborar preparaciones en fresco:

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En gota pendiente con muestras de agua de lago. Enfocar y esquematizar a 40x En porta normal, enfocar y esquematizar a 40x ∼Localizar protozoarios y algas microscópicas.

Elaborar tinción negativa:

°

Con una muestra de pulque; teñir con nigrosina ° Colocar una gota de pulque y una de nigrosina paralelamente sobre el porta y mezclar con el asa ° Realizar un extendido con otro portaobjetos ° Dejar secar esquematizar a 40x

Preparación de frotis: 1. 2.

Calentar el asa de inoculación hasta que este al rojo. Tomar la porción de la muestra que se va a examinar por medio de una asa o escobillón Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin grasa, debidamente marcado

3.

4.

5.

Trazar con la muestra una espiral del centro a la periferia (Si la muestra no es líquida, colocar una pequeña gota de solución salina sobre el portaobjetos antes de realizar el frotis y disolver en ella la muestra )

Calentar nuevamente el asa para desinfectarla. 6.

Dejar secar el frotis al medio ambiente.

7. Fijarlo pasándolo tres veces a través de la llama con la muestra hacia arriba. 8. Dejar enfriar el frotis antes de colorearlo

Tinción simple:

°

Cubrir con safranina (1min) ∼Eliminar exceso y lavar con agua para eliminar restos de decolorante

6

∼Observar al microscopio

Tinción de Gram.: ° Cubrir con violeta (1min) ° Cubrir con lugol (1min) ° Decolorar con alcohol-acetona gota a gota ° Cubrir con fascina básica (1min) ∼Eliminar exceso y lavar con agua para eliminar restos de decolorante ∼Observar al microscopio ∼Entre cada paso lavar con agua

de

genciana

DISCUSIÓN DE RESULTADOS:



Se realizaron 2 tipos de preparaciones con agua del lago de chapultepec en fresco: en gota pendiente, donde se observaron muy pocos protozoarios y algunas algas y en porta normal en donde e logró observar también algas y protozoarios pero en mayor cantidad, más definidos y con mayor claridad. En ambas preparaciones, se logró observar la movilidad, el tamaño y la forma de los microorganismos; sin embargo no se lograba observar muy definidamente sus características esenciales (conformación) y además el líquido hacía que se movilizaran en el, lo que no permitía un estudio adecuado.



Se realizaron 3 tipos de tinciones; la primera fue la tinción negativa con muestra de pulque, en la que se observaron cadenas de levaduras, cadenas de levaduras, bacilos, cocos, diplococos. Se observó que el fondo era púrpura y las bacterias y levaduras quedaban en blanco muy brillante lograron observar las cápsulas, que estaban rodeadas de negro pero no se teñían las cápsulas, esto debido a que las partículas de colorante no pueden penetrar la cápsula debido a que es una estructura protectora de las bacterias que las protege.



En la tinción simple (que se realizó con safranina), se observaron levaduras, levaduras en cadena, bacilos y cocos; Se colorearon todos de rojo incrementando así el contraste al ser observadas por el microcopio y así dejando observar más claramente sus partes.



En la tinción de Gram., se observaron cocos grampositivo de color morado en el centro en cadena, solos y como diplococos y levaduras, que se tiñeron de rosa, pero ya que no son bacterias, por lo tanto no son gram. Algunos cocos no se tiñeron de morado, sino de rosa, o ni siquiera se tiñeron, lo que indica que son gramnegativos, esto debido a que las gramnegativos poseen una membrana externa que las protege del colorante, en cambio las grampositivas no tienen membrana, lo que permite que se tiñan de esta manera diferenciarlas.

CONCLUSIONES: Con esta práctica se aprendió a realizar adecuadamente los tipos preparaciones que se utilizan en microbiología, además de la correcta preparación de un frotis para poder realizar posteriormente las tinciones más utilizadas para el laboratorio de microbiología que son indispensables para el correcto estudio de los microorganismos; así mismo mediante la realización de estas tinciones y preparaciones se logró observar la forma, agrupación y cápsula, además de características de locomoción de algas y protozoarios, así como de algunos tipos de levaduras, que aunque no son bacterias algunas de esta preparaciones y tinciones nos ayudan también a observar algunas de sus características.

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Con lo estudiado y observado anteriormente se llegó a la conclusión de que conocer las técnicas de preparación de frotis y tinciones son indispensables para la microbiología ya que facilitan el estudio de los microorganismos, así como el estudio de su conformación, agrupación y características fundamentales.

REFERENCIAS: http://aulavirtual.usal.es/ http://www.ucbcba.edu.bo/ Manual de microbiología general de la UNAM: Velásquez, M. O.; Vierna, G. L. y Luna, M. B. : Manejo y cuidado de los microorganismos. Pp.25-32

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