2007 Aaps - Poster - High Throughput Solubility Analysis

High Throughput Solubility Analysis; a Tailored Approach to Supporting Drug Discovery Efforts  Charles E. Taylor, Robyn A. Rourick and John P. Walsh  Kalypsys, Inc. Pharmaceutical Sciences Department  10420 Wateridge Circle, San Diego, CA 92121 

Objectives  • Expanded assay to include multiple buffer solutions being used in‐house  • Fully automated solubility assay  → Robotic plate movement  → Automated plate reading  • Server based data handling  → Queuing system integrated with proprietary “Request System”  → Curve fitting tools  → Automated report generation and archival 

Optimization 

Stock Plate 

0.45 µM 

UV Plates 

96 Well   Shallow Well 

Acetonitrile 

Process Plates 

40µL 

160µL 

Buffer Solubility Comparison

Solvents 

200µL 

Verapamil Solubility

600

96 Well  

96 Well  

UV Plate 

UV Plate 

500 400 300 200 100

Sa lin e

-100 -200

260nm to 500nm  Figure  1:  Illustration  showing  the  effect  of  shake  time  on  the  sample  results.    4.5  hours  was  chosen  because  it  provides  most  of  the  compounds  enough  time  to  4.5 Hrs  reach  equilibrium.  The  compounds  used  in  the  illustration  were:    clozapine,  t a m o x i f e n ,   k e t o c o n a z o l e ,  chlorpromazine,  chloramphenicol,  7.00 14.00 21.00 28.00 35.00 42.00 49.00 56.00 63.00 70.00 furosemide, 2‐naphthoic acid and 4,5‐DPI 

Effect of Shake Time in Sample  Values 3.5 3

AU of  Samples

2.5 2 1.5 1 0.5 0 0.00

Hours of Shaking Conc. (µM) 

500  500  200  200 

50 

Organic Buffer (µL)  285  285  380  380   

 

12 

12 

10 mM stock (µL) 

 15 

 15 

8 

 8   

Transfer (µL) from  Col 3& 4  

 

 

 

Transfer (µL) from  Col 5& 6  

 

Transfer (µL) from  Col 7& 8 

 

   

   

   

12.5  12.5  3.13  3.13 

0 

0 

Figure  3:  Chart  illustrating  the  different  solubility  values  obtained  for  each  of  the  buffers  tested.    Ketoconazole  is  represented  by  the  blue  bars,  and  Verapamil  is  represented  by  the  yellow  bars.    The  validated  phosphate  buffer  replicates,  which  were  used  as  controls,  are boxed in red. 

15   100     

15 

15 

15 

15 

15 

15 

15 

 

 

 

 

 

 

 

100 

 

  

  

  

  

  

   

100   100   

 

 

 

100  100 

   

   

Table  1:  Liquid  aliquots  and  serial  dilution  volumes  used  in  constructing  the  calibration  concentrations used to determine the unknown sample concentrations.  Organic buffer  refers  to  the  20%  Acetonitrile  composition  in  the  buffer  being  used  to  construct  the  calibration  curve.    Acetonitrile  helps  to  maintain  the  higher  concentrations  of  the  compound in the calibration curve. 

100

200

300

400

500

600

Concentration [uM] 3.  Informatics Tools  • Queuing system  • Curate results  • Automated PDF report generation and archival 

Figure  6:  User curate ability  in Solubility Manager 

Figure 7: Incoming sample queue.  Setup 

2.  Fully Automated Assay  • Validate the use of a liquid handler with specific automation  components: 

Verapamil

A.  Robotic Arm  B.  Shaker 

Verapamil

C.  Vacuum Block  D.  UV Plate Reader 

Figure  8:  Sample  results  page  (from  left  to  right);  pass/fail  indicator,  tabulated  results,  triplicate spectra, calibration spectra, calibration curve, structure, compound ID,  plate barcode, and well location. 

B  D 

0

Figure  10:  Bar  chart  showing  the  historical  use  of  the  solubility  assay.    The  effect  of  introducing  a  fully  automated  solution  provides  that  many  FTE  hours  will  be  saved, and the use of the assay will increase with the throughput.    

Buffer Systems

285  285  285  285  285  285  285  285 

DMSO(µL) 

 

50 

S D (p M H EM 7. 4) (-p he D no M U EM AB lr ed / O (-p ) A he B no Pl at lr e ed 1 )+ 5% R R PM PM FB I( I( S -p -p he he no no lr lr ed ed ) )+ 5% U AB FB /O S A H B BS Pl S at + e 2 2 C 0m M Y et P M 45 ab H 0 ep ol As ic es S s a ta y bi Bu lit y f fe As r sa y Bu U AB ffe r /O A B AD Pl M B at ag e K ic in 3 B a se uf fe B rf uf or fe r N eu tro ph M ils ag ic B uf U fe AB r /O 2 A B Pl at e 4

0

UV Plate Read 

0

5

Ketoconazole Solubility

700

Transfer  Volume 

0

10

7‐Oct‐07

Table  2:    Summary  of  the  Pass/Fail  results  for  the  various  buffers  in  the  system.    The  automation  capable  category  considers  the  success  with  which  the  buffer  was  handled by the Tecan liquid handler and/or shaker.  A High Standard Deviation of  the  samples  is  indicative  of  a  ruggedness  problem  for  inter‐  or  intra‐day  reproducibility.  A failure in the baseline absorbance category would occur if the  buffer  system  showed  a  chromophore  of  significant  enough  intensity  to  affect  the  current  quantitation  limits.    Intertwined  calibration  absorbance  curves  are  often a result of a poorly behaving UV solvent with compound. 

0.5

15

7‐Aug‐07

Filter @ 

1

Manual 1 BioA 1 Profiler 1 Profiler 2 Profiler 3 Profiler 4 Profiler 5 Profiler 6

7‐Jun‐07

Process  Step 

1.5

20

7‐Apr‐07

@ 200RPM 

Verapamil

25

7‐Feb‐07

Legend 

Concentration [uM]

30

7‐Dec‐06

4.5 Hrs 

600

7‐Oct‐06

Dilution 

500

7‐Aug‐06

Serial    

400

7‐Jun‐06

(Calibration) 

300

7‐Apr‐06

(Samples) 

200

7‐Feb‐06

w/ 20% Acetonitrile 

100

7‐Dec‐05

Deepwell Plate 

0

35

7‐Oct‐05

Filterplate 

0

40

7‐Aug‐05

Phosphate Buffer 

0.2

45

7‐Jun‐05

96 Well  

0.4

Manual 1 BioA 1 Profiler 1 Profiler 2 Profiler 3 Profiler 4 Profiler 5 Profiler 6

7‐Apr‐05

96 Well  

Intertwined   Baseline   Automation  High Std. Dev.  Calibration   Buffer  Capable  Of Samples  Absorbance  Absorbance  Saline  Pass  Pass  Pass  Pass  PBS (pH 7.4)  Pass  Pass  Pass  Pass  DMEM (‐phenol red)  Pass  Fail  Fail  Fail  DMEM (‐phenol red) + 5% FBS  Fail  Pass  Fail  Fail  RPMI (‐phenol red)  Pass  Pass  Fail  Fail  RPMI (‐phenol red) + 5% FBS  Fail  Pass  Fail  Fail  HBSS + 20mM Hepes  Pass  Pass  Pass  Pass  CYP450 Assay Buffer  Pass  Pass  Pass  Pass  Met. Stab. Assay Buffer  Pass  Pass  Pass  Pass  ADB Kinase Buffer  Pass  Pass  Fail  Pass  Magic Buffer for Neutrophils  Pass  Pass  Pass  Pass  Magic Buffer 2  Pass  Pass  Pass  Pass 

AU

46µL 

0.6

AU

10 µL 

0.8

• Must be automation capable  

DMSO 

Phosphate  

1

Solubility Assay Metrics

7‐Feb‐05

• Test multiple buffers used in various groups 

170 uL 10mM DMSO Stock 

Shake 

Ketoconazole

Figures  5a  and  5b:  Graphs  illustrating  six  replicate  calibration  curves  for  the  respective  compounds,  which  were  constructed  by  the  fully  automated method.  Also  in  the  graphs  are  a  manually  prepared  calibration  curve  and  a  s e m i ‐ a u t o m a t e d  calibration  curve.    This  graphs  illustrate  the  capability  of  the  fully  automated  method  in  production. 

Compounds

96 Well  

Buffer 

Output and Metrics 

1.  Buffer Expansion Work 

PB

Purpose:  Solubility  is  a  widely  utilized  assay  throughout  the  Drug  Discovery  projects at Kalypsys.  To increase the throughput, reduce the resource  cost  and  maintain  the  credibility  of  the  current  assay,  we  aim  to  deploy a completely automated modified shake‐flask solubility assay  that is capable of analyzing various buffer types.       Methods: Using a modified shake flask method, a medium throughput plate‐ based method was developed and qualified against literature values.   This method employed a filter plate as the shake vessel; allowing for  ease  of  post‐agitation  precipitate  filtration.    Calibration  gradients  in  an organic mixture of the buffer allow for quantification of the sample  solubility.    UV  plates  were  used  to  read  both  the  sample  and  calibration  solution  absorbances;  the  latter  provides  for  a  linear  correlation of the UV absorbance to concentration.     Initially,  this  procedure  was  performed  manually  with  multichannel  pipettes with the user taking the plates to various instruments.  The  next  evolution  automated  the  liquid  handling  on  a  disposable  tip  liquid‐handler.    In  this  configuration,  the  assay  was  expanded  to  include  analysis  in  multiple  buffer  types;  all  buffers  used  in  the  company were investigated for solubility analysis compatibility.      The  next  design  iteration  was  to  increase  the  assay  throughput;  achieved  by  migrating  the  assay  to  an  integrated  platform  and  upgrading the data handling tools for the assay.  A liquid handler with  the  accessories  capable  of  processing  the  solubility  assay  was  installed;  this  system  allowed  for  a  theoretical  throughput  of  84  compounds  in  5  hours.    With  the  data  quantity,  a  server  based  data  handling  package  was  needed  for  the  purpose  of:  a  sample  queuing  system,  requesting  test  articles  from  compound  management,  parsing  raw  data  files,  curve  fitting,  outlier  sample  exclusion  and  automated report generation.      Results:  The assay was successfully migrated to the fully automated platform,  with the capability of analyzing solubility in multiple buffer types.  The  data  handling  tools  were  successfully  implemented.    Each  method  developed  was  qualified  by  performing  a  parallel  analysis  in  the  previous method(s); the assay was deployed only after qualification.      Conclusions: The deployment of this assay, with its versatility and throughput  has greatly impacted the Discovery efforts at Kalypsys. 

Experimental 

Concentration [uM]

Introduction/Abstract 

10 minutes 

10 minutes 

Sample  20 minutes  Plate Prep 

5 minutes 

N/A 

Cal Plate  3 hours   (28 Cmpds) 

40 minutes 

N/A 

Sample  Analysis 

20 minutes 

10 minutes 

N/A 

Data   Analysis 

1 hour 

15 minutes 

15 minutes 

 

10 minutes 

4 hours 40 minutes 

1 hour 20 minutes 

25 minutes 

Figure  11:  FTE time dedicated to the assay at the various levels of development for a typical  run size of 28 compounds.  The data analysis time for the manual method is higher  as that method was deployed before the Informatics Tools were deployed.  

Acknowledgements  The authors would like to thank the following individuals for their time and effort  in  bringing  this  assay  to  deployment  and  optimizing  it  for  higher  throughput:  Mike Calcagno, Qiner Yang, Frank Balistrieri , Chris Peterson and Katie Belsky. 

C 

Figure  4:  Bed  layout  of  the  robotic  deck  that  is  used  to  process  the  fully  automated  solubility assay. 

Figure  9:  From  the  results  displayed in Figure 7,   automatically generated PDF reports  are  created    and  archived  in  a  Solubility  Report  Library  on  the  company  intranet.    The  results  are  also  maintained  in  an  Oracle®  table,  which  can  be  data mined or displayed in SAR tables.   

Document Number 

Description 

AC_M T_Solubility_v1  AC_HT_Solubility_v1  AC_MT_Solubility_Expansion_v1  AC‐MethDev‐2006‐012v1 

Semi‐Auto and Manual Solubility Assay  Fully Automated Solubility Assay  Multiple Buffer System Validation  Fully Automated Solubility Assay Development