(2) Modulation Of Chromatin

2. Modulation of Chromatin Structure  Chromatin structure is dynamic rather static   Practically we can consider modulation of  chromatin structure at two levels: effects on  nucleosome and effects on higher order structure

 

 

Transcription factor binding to DNA is  inhibited within nucleosomes • • • • •

Chromatin assembly inhibits transcription by all three RNA  polymerases in vitro. In vivo genetic evidence links histones to repression (and activation as  well). Affinity of transcription factor for its binding site on DNA is decreased  when the DNA is reconstituted into nucleosomes. The binding of TBP to the TATA box is very sensitive to chromatin  assembly in vitro.   Extent of inhibition is dependent on: – Location of the binding site within the nucleosome. • binding sites at the edge are more accessible than the center – The type of DNA binding domain.  • Zn fingers bind more easily than bHLH domains.  

 

Stimulate binding of transcription  factors to nucleosomes • Cooperative binding of multiple factors. • The presence of histone chaperone  proteins which can compete H2A/H2B  dimers from the octamer. • Acetylation of the N­terminal tails of the  core histones • Nucleosome disruption by ATP­dependent  remodeling complexes.  

 

Mechanisms for chromatin remodeling –Modulation by incorporation of histone variants –Modulation by ATP­driven chromatin remodeling complexes –Modulation by enzymes that post­translationally modify  histones Acetylation Methylation Ubiqitination Phosphorylation ADP­ribosylation  

 

There are  a large  number of  Histone  H2A  variants.  The  function of  these  variants  are just  begun to  be  revealed  

 

Modulation by Histone Variants • In addition to the major histones H2A, H2B, H3  and H4, many organisms also have distinct  batteries of histone variants

– H2AZ and H2AX   H2AZ has been shown to associate with actively  transcribed chromatin regions  H2AX has been shown to be crucial for chromatin  decompaction during DNA repair. Phosphorylation on its  SQE/DØ sequence is one of the earliest events in  response to double­strand DNA breaks – H3.3 and CenH3s (CenpA in human)  H3.3 is a replacement H3 variant  CenH3s are centromere­specific H3 variants

    • Histones H2B and H4 have very few variants

Histone H3 variants 

CenpA is required for the specific structure and      function in centromere

Conclusions The chromatin structure and function can be  different dependent on the presence or absence of  histone variants because their differences in amino  acid sequences and conformations. We are still at  the very early phase in term of understanding the  roles of histone variants.

 

 

Remodeling by ATP­driven  chromatin remodeling complexes

• Yeast SWI/SNF

– 10 proteins – Needed for expression of genes involved in mating­type  switching and sucrose metabolism (sucrose non­ fermenting). – Some suppressors of swi or snf mutants are mutations  in genes encoding histones. – SWI/SNF complex interacts with chromatin to activate a  subset of yeast genes. – Is an ATPase

• Mammalian homologs: hSWI/SNF

– ATPase is BRG1, related to Drosophila Brahma     • Other remodeling ATPase have been discovered.

Partial list of chromatin remodeling  complexes

 

Complex SWI/SNF RCS NRUF CHRAC ACF BRM BRG­1 hBRM associated complexes

Organism Yeast Yeast Drosophila Drosophila Drosophila Drosophila Mammals Mammals  

Factor swi/snf sth1 ISWI ISWI ISWI BRM BRG BRM

 

 

Chromatin Remodeling Factors             ATPase

Species  Yeast

              subunit SWI/SNF complex             SWI/SNF2 RSC complex STH1

Drosophila

NURF CHRAC ACF BRM complex

ISWI ISWI ISWI BRM

Human

BRG1 complex hbrm complex

BRG1 hbrm

•Remodeling activity is dependent on or associated with ATP hydrolysis. •NTP binding subunit possesses DNA­stimulated ATPase activity. •Postulated that the NTP binding subunit acts as a processive, ATP­driven DNA­                         translocating motor that disrupts histone­DNA interactions.     

 

How do chromatin remodeling  complexes work?  • Structural alteration • Nucleosome sliding • Nucleosome eviction

 

The consequence of chromatin remodeling is  dependent on the type of chromatin  remodeling complexes involved  

Remodeling by SWI/SNF SWI/SNF + ATP Nucleosome

Based on in vitro studies using  reconstituted nucleosome and  purified SWI/SNF complexes 

 

1. 2. 3.

Structural alteration  Generation of stable dimers   Octamer transfer

Chromatin remodeling ATPases catalyze  stable alteration of the nucleosome

II: form a stably remodeled dimer, altered DNAse digestion pattern III: transfer a histone octamer to a different DNA fragment  

 

Involvement of SWI/SNF in transcription •

The SWI/SNF complex is required for transcriptional activation of 5% yeast genes.

•

Can be recruited directly through interaction with DNA binding transcription factors.

•

Can be recruited indirectly by interaction with other transcriptional coactivators or along with the RNA polymerase holoenzyme.

•

Other unidentified chromatin-remodeling activities might be recruited by pathways as yet undefined.

•

SWI/SNF complex exerts its major effect in transcriptional activation at a step subsequent to transcriptional activator-promoter recognition.

•

In the yeast, the SWI/SNF complex has been proposed to antagonize the repressive effects of chromatin by disrupting nucleosomes.

•

Dependent on the chromatin organization as well as the transcription factors involved, the SWI/SNF also contributes to transcriptional repression.    

Nucleosome sliding induced by ISWI­ containing complexes NURF +ATP

NURF +ATP

TF

Stable, low energy state

NURF +ATP

Evenly spaced nucleosomes

Allow TF to bind

• Make nucleosome mobile in the presence of ATP • Also involve in nucleosome/chromatin assembly   •  Have roles in both transcriptional activation and repression

Recent evidence: nucleosome  eviction as a result of chromatin  remodeling by SWI/SNF Yeast Pho5 gene Induction with low phosphate

Swi4/ Pol II swi6

• Promoter region is DNase I hypersensitive upon induction • Promoter region contains less histones after induction  

 

Remodeling by covalent modification  of histones in chromatin

 

 

 

Multiple modifications and enormous potential  combinations  

Two types of Histone  Acetyltransferases (HATs). • Type A nuclear HATs:  acetylate histones in  chromatin. • Type B cytoplasmic HATs: acetylate free  histones prior to their assembly into  chromatin. – Acetylate K5 and K12 in histone H4

Acetylation by nuclear HATs is associated  with transcriptional activation • Highly acetylated histones are associated with actively  transcribed chromatin

– Increasing histone acetylation can turn on some genes. – Immunoprecipitation of DNA cross­linked to chromatin with  antibodies against Ac­histones enriches for actively transcribed  genes. 

• Acetylation of histone N­terminal tails affects the ability of  nucleosomes to associate in higher­order structures – The acetylated chromatin is more “open”

• DNase sensitive • accessible to transcription factors and polymerases

• HATs are implicated as co­activators of genes in  chromatin, and HDACs (histone deacetylases) are  implicated as co­repressors    

Nuclear HAT As are coactivators • Gcn5p is a transcriptional activator of many genes  in yeast.  It is also a HAT. • PCAF (P300/CBP associated factor) is a HAT and  is homologous to yeast Gcn5p. • P300 and CBP are similar proteins that interact  with many transcription factors (e.g. CREB, AP1  and MyoD). • P300/CBP are needed for activation by these  factors, and thus are considered coactivators. • P300/CBP has intrinsic HAT activity as well as  binding to the HAT PCAF.    

Table 1. HAT families and their transcription-related functions (adapted from Marmorstein and Roth, 2001)

 

HAT family GNAT

Members Gcn5, PCAF, Ada, SAGA Hat1 Elp3, Hpa2

Function Coactivator Replication dependent chromatin assembly

MYST

Sas2, Ybf2/Sas3, Esa1 MOF, Tip60 MOZ HBO1

Silencing, Cell cycle progression Dosage compensation Leukemogenesis Origin recognition interaction

TAFII250

TAFII250

TBP-associated factor

CBP/p300

CBP, p300

Global coactivator

SRC

SRC-1, ACTR, SRC-3 TIF-2, GRIP1

Steroid receptor coactivators

ATF-2

ATF-2

Sequence specific DNA binding activator

TFIIIC

TFIIIC

RNA pol III initiation

 

HAT complexes often contain several  transcription regulatory proteins. • Example of the SAGA complex components: • Gcn5: catalytic subunit, histone acetyl transferase • Ada proteins – transcription adaptor proteins required for function of  some activators in yeast. • Spt proteins (TBP­group) – regulate function of the TATA­binding protein. • TAF proteins – associate with TBP and also regulate its function. • Tra1

– homologue of a human protein involved in cellular transformation.    – May be direct  target of activator proteins.  

Roles of histone acetylation • Increase access of transcription factors to  DNA in nucleosomes. • Decondense 30nm chromatin fibers • Serve as markers for binding of non­histone  proteins (e.g. bromodomain proteins).

 

 

Effect of Histone Acetylation on Chromatin Structure and Transcription

 

 

Histone deacetylation is catalyzed by  histone deacetylases and associated  with transcriptional repression Histone deacetylases (HDACs): 2. Three classes, about 20 identified members. 3. can be recruited by transcriptional repressors to    specific target genes and/or deacetylate  histones in chromatin in a non­targeting, global  fashion. 4. Acetylation and deacetylation are very dynamic  events 5. Aberrant histone deacetylation has been linked    to cancer  

Effect of Histone Acetylation on Chromatin Structure and Transcription Repression

Activation  

 

 

 

Information about three classes of  HDACs • Class I HDACs are relatively small in size,  abundant, ubiqitously expressed, mainly nuclear,  sensitive to TSA and tend to associate  corepressor proteins to form large corepressor  complexes. • Class II HDACs are relatively larger in size, less  abundant, shuffling between cytoplasm and nuclei,  likely tissue­specific and sensitive to TSA. • Class III HDACs are less well known and involved  in silencing of rRNA genes and telomere silencing  and not sensitive to TSA.  

 

 

 

HDAC inhibitors can induce cell differentiation  possibly through induction of p21 and cyclin D1and  has been tested as cancer treatment drugs in  clinical trials    

Class I HDACs are found in large protein  complexes HDAC3 SMRT/ N­CoR

HDAC1/2 RbAp46

TBL1 TBLR1

Sin3A

GPS2

RbAp48 SAP18

SMRT/N­CoR complexes                    Sin3A complex

 

 

Comparison of Sin3, Mi­2/NURD and  SMRT/N­CoR class I HDAC complexes   Sin3   

  Mi­2/NURD   

  SMRT/N­CoR   

  HDAC1/HDAC2   HDAC1/HDAC2   HDAC3

Histone  deacetylases WD­40 repeat histone­     binding proteins

  RbAp46

  RbAp46

  TBL1

  RbAp48

  RbAp48

  TBLR1

  SAP18

  MTA2

  GPS2

  SAP30

  MBD3

  IR10

  Sin3

  CHD3/CHD4

  SMRT/N­CoR

Scaffold  proteins

  MeCP2

  MBD2

  Kaiso

Methyl CpG binding protein

 

 

Repression by deacetylation of histones  by SIR2

 

 

Methylated DNA can recruit HDACs

 

 

Histone Methylation

 

 

Histone Methylation • Two types of HMTs: arginine specific­HMTs and lysine­ specific HMTs. • Histone methylation (mono­, di­ and tri­methylation) is  known for a long time, but the HMTs responsible for  histone methylation have only recently been identified. • In contrast to histone acetylation, histone methylation is  stable. Turnover rate of histone methylation is similar to  that of histone turnover. • The first identified Arg­specific HMT is Carm1/PRMT1. It  can methylates Arg­2, Arg­17 and Arg­26 in H3. It functions  as a transcriptional coactivator for nulcear hormone  receptor. • The first identified Lys­specific HMT is SUV391, based on  its similarity to plant protein metyltransferase. The  enzymatic activity resides in the highly conserved SET  (Suppressor of variegation, Enhancer of Zeste and      Trithorax) domain.

Nature (Article) 406, 593­599. Aug. 10, 2000

Regulation of chromatin structure by  site­specific histone H3 methyltransferases Stephen Rea, Grank Eisenhaber, Donal O’Carroll, Brian D. Strahl, Zu­Wen Sun, Manfred Schmid, Susanne Opravil, Karl Mechtler, Chris P. Ponting, C. David Allis & Thomas Jenuwein

1. Human and murine SUV39H1 contains a SET domain   resembling plant methyltransferase proteins 2. Human and murine SUV39H1 is a H3 K9 Specific HMTase 3.  Mapped the catalytic motif (SET domain plus the adjacent  cysteine­rich regions) 4.  K9 methylation interferes with S10 phosphorylation 5.   Suv39h1 null cells have heterochromatin defects  

 

Approaches for identification and  characterization of HMTs 1. Biochemical purification of HMT activities using in vitro  HMT assay. 2. Sequence similarity: testing the proteins containing a SET  domain.

 

 

Summary of Known HMTases and Their Target Sites HMTase

Histones

Sites

Roles in transcription

CARM1

H3

R2, R17, R26

PRMT1

H4

R3

activation

Suv39H1/Clr4/ESET/

H3

K9

silencing

ySET1/mSET9/mSET7

H3

K4

Silencing and elongation

ySET2

H3

K36

elongation

G9a

H3

K9, K27

silencing

EZH1/EZH2

H3

    K27

silencing

DOT1

H3

K79

Not clear

SET8

H4

K20

Silencing, cell cycle

 

 

Activation and elongation

Underlining mechanisms • H4­R3 methylation facilitates acetylation of  H4 by p300 (why it is associated with  activation. • H3­K9 methylation creates a binding site for  HP1 and HP1 is known to associate with  HDACs and involved in heterochromatin  formation (why it is involved in repression) • The underlining mechanism for many other  modifications is not clear   

 

Histone phosphorylation • Phosphorylation on Ser­10 of H3 is involved in  both transcriptional activation and in chromosome  condensation during mitosis. • Phosphorylation on Ser­10 of H3 facilitates  acetylation of histone H3 on Lys­9 and Lys­14. • Phosphorylation of histone H2X variant is involved  in DNA repair • Many Ser and Thr sites in histone tails can be  phosphorylated. In most cases the functional  consequence is not clear.  

 

Histone Ubiqitination • H2A (Lys­119) and H2B (Lys­123) can be  mono­ubiqitinated. • Mono­ubiqitination is not associated with  protein degradation by proteasome  pathway. • H2B ubiqitination in yeast is catalyzed by  Rad6 and is required for methylation on Lys­ 4 and Lys­79. The underlining mechanism is  unknown.  

 

Interplay Between Different Histone Modifications

Human H3

Human H4

 

Me Me

Me Ac p

Ac

Me Ac

Ac

Me Me p

9

14

18

23

27

N­ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP... 4

Me

Me Ac

Ac

Ac

Ac

Me

3 5

8

12

16

20

Ac­N­SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGIT...

 

 

Multiple modifications and enormous potential  combinations: histone code theory   

‘Histone Code’ and How the Code be Read? Histone code hypothesis: that multiple histone modifications, acting in         combinatorial or sequential fashion on one or multiple histone tails,         specify unique downstream functions. How the histone code be read?  Likely read by specific protein domains Code

Protein Motif

Ac­Lys

Bromo

Me­K9

HP1 Chromo

Me­K27

Polycomb Chromo

Phos­S10

 

Different combinations

?

 

?

Optimal transcriptional activation  requires multiple chromatin remodeling  factors

 

 

Functional interplay among different  chromatin remodeling factors? The functions of SWI/SNF and the  SAGA complex are genetically linked • Some genes require both complexes for  activation. • Other genes require one or the other complex. • Many genes require neither ­ presumably utilize  different ATP­dependent complexes and/or HATs  

 

The Order of Recruitment? The yeast HO endonuclease gene requires both SWI/SNF  and SAGA

• The order of recruitment at the HO promoter: – 1. SWI5 activator: sequence recognition – 2. SWI/SNF complex: remodel nucleosomes – 3. SAGA: acetylate histones – 4. SBF activator (still at specific sequences) – 5. general transcription factors

• Cosma, Tanaka and Nasmyth (1999) Cell 97:299­ 311.

• The order is likely to differ at different genes  

 

A scenario for transitions from  silenced to open to actively  transcribed chromatin

 

 

Movement from hetero­ to euchromatin

 

 

Nucleosome  remodelers  and HATs  further open  chromatin

 

 

Assembly of  preinitiation  complex on  open  chromatin