2- Effetti Biologici Delle R.i

Effetti biologici delle radiazioni ionizzanti Corso di aggiornamento per T.S.R.M. Villanovaforru, 27-28 maggio 2005 Prof. Francesco Cossu 1

Settori della radiobiologia • Nella ricerca teorica di base: – Studio degli effetti delle radiazioni su sistemi biologici (Rb generale)

• In campo applicativo – La conoscenza della radiobiologia è premessa fondamentale per • La radioterapia • La radioprotezione 2

Radiazioni ionizzanti utilizzate in Radioterapia • Radiazioni direttamente ionizzanti – elettroni veloci – protoni – deutoni...

• Radiazioni indirettamente ionizzanti – fotoni (X e gamma) – Neutroni 3

Isotopi per brachiterapia 226Ra

125

I

192

Ir

60

Co

137

Cs

90

Sr - 90 Y 4

Unità di misura delle radiazioni ionizzanti •

Dose di esposizione in aria Roentgen internazionale (R) KERMA in aria (GY)

•

Unità di dose assorbita: Gray (Gy): 1 Gy = 100 rad = 1 J/ Kg

•

• •

Unità di materiale radioattivo Curie (Ci): 1 Ci= attività di 1 g di Ra226 Becquerel (Bq) : 1 Bq = 1 dis/s 1 Ci = 3.7x 10 10 dis/s Trasferimento lineare di energia (LET) (KeV/µm) Efficacia biologica relativa (RBE) Sievert (Sv): Sv= Gy x Q (Q=fattore qualità) 5

Fattore di qualità (Q) e LET

6

Variazioni della risposta biologica •

Fattori fisici – – –

•

Tipo ed energia della radiazione Entità della dose assorbita e frazionamento Volume irradiato

Fattori biologici – –

Fattori caratteristici del sistema biologico (sensibilità, cinetica, metabolismo, possibilità di recupero e riparazione del danno) Caratteristiche dell’ambiente circostante (nutrizione, ossigenazione, vascolarizzazione, competitività biologica, omeostasi, reattività immunitaria). 7

Successione degli eventi (1) dall’emissione della radiazione al danno biologico

• • • • • •

Interazioni iniziali (fase fisica) Stadio fisico-chimico Danno chimico Danno bio-molecolare Effetti biologici precoci Effetti biologici tardivi 8

Successione degli eventi (2) dall’emissione della radiazione al danno biologico

• Fase fisica – Emissione dell’energia raggiante – Trasferimento dell’energia attraverso lo spazio (fascio di radiazioni) – Assorbimento dell’energia da parte degli atomi della materia attraversata (interazioni fra radiazioni e materia)

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Successione degli eventi (3) dall’emissione della radiazione al danno biologico

• Fase chimica Scissione di legami o formazione di nuovi e diversi legami interatomici con modificazioni strutturali delle molecole di interesse biologico, sotto forma di:  Rottura di catene principali o collaterali  Formazione di ponti intra-molecolari  Formazione di ponti inter-molecolari 10

Successione degli eventi (4) dall’emissione della radiazione al danno biologico

• Fase biologica 1. Livello cellulare Morte cellulare Morte riproduttiva Perdita di funzioni specifiche Alterazioni dell’informazione ereditaria (alterazioni cromosomiche, mutazioni geniche)

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Successione degli eventi (5) dall’emissione della radiazione al danno biologico

• Fase biologica 2. Popolazioni cellulari Effetti graduati precoci e tardivi per danno al connettivo Effetti graduati precoci e tardivi per danno ai parenchimi Alterazioni stocastiche per mutazioni geniche (induzione di neoplasie) 12

Successione degli eventi (6) dall’emissione della radiazione al danno biologico • Fase biologica 3. Organismo intero Panirradiazione con dosi elevate • >10 Gy: morte per s. gastro-intestinale • 4- 10 Gy: rischio di morte per s. emopoietica • < 4 Gy: vari danni proporzionati alla dose Irradiazione cronica a piccole dosi: • Effetti graduati (sistemi sensibili: cute, cristallino, midollo osseo, gonadi) • Effetti statistici (mutazioni geniche: induzione di leucemie e neoplasie solide)

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Catena di eventi dall’emissione di energia alla lesione da radiazioni EVENTO

da

a

Interazioni iniziali: fotoni, neutroni

10 -24

10 -14 s

Interazioni iniziali: particelle cariche 10 -16

10 -14 s

Stadio fisico-chimico

10 -12

10 -8 s

Danno chimico

10 -7

ore

Danno biomolecolare

ms

ore

Effetti biologici precoci

ore

settimane

Effetti biologici tardivi

anni

secoli 14

Modificazioni chimiche da assorbimento di radiazioni • L’assorbimento di radiazioni ionizzanti produce eccitazioni e ionizzazioni a caso nelle molecole. Nella materia vivente la maggior parte di energia viene assorbita dalle molecole dell’acqua. • La ionizzazione dell’acqua porta alla formazione di radicali liberi (H• ed OH•) ed e - (+ e - aq ). 15

Modificazioni chimiche reazioni dei radicali – I radicali liberi possono reagire tra loro H• + H• → H2 OH• + OH• → H2O2 H• + OH • → H2O – Possono reagire con altre molecole d’acqua H2O + H • → H2 + OH• – Possono reagire con i prodotti delle reazioni H2O2 + OH• → H2O2 + HO2• – Possono estrarre idrogeno da molecole organiche RH + OH → R• + H2O RH + H• → OR• + H2 16

Modificazioni chimiche Effetto diretto ed indiretto • L’effetto diretto è determinato dalla ionizzazione delle molecole biologiche ad opera della radiazione RH ---- radiazione → RH+ + e- → R• + H+ • L’effetto indiretto è determinato dai radicali che si formano nella radiolisi dell’acqua

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Modificazioni chimiche effetto diretto ed indiretto delle radiazioni radiazione

radiazione radicali dell’acqua molecola bersaglio bersaglio biologico

effetto diretto

effetto indiretto

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Modificazioni chimiche radicali ed effetto ossigeno • In presenza di ossigeno si formano radicali idroperossidi relativamente stabili (HO2) e perossido di idrogeno (H2O2), per reazione con i radicali liberi H• ed e aqO2 + H• → HO2• O2 + e aq- → O2O2- + H+ → HO2 2 HO2• → H2O2 + O2

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Effetti dell’irradiazione sulle proteine • Le proteine costituiscono la base organica più importante del citoplasma. • L’irradiazione determina: – Variazione di solubilità; – Riduzione del peso molecolare; – Scompaginamento delle strutture secondarie e terziarie; – Formazione di ponti ed aggregati fra molecole, con conseguente perdita di funzione; – Inattivazione di enzimi.

• Tutti gli effetti sono dose-dipendenti. 20

Effetti dell’irradiazione sugli acidi nucleici • La massima attenzione è rivolta al danno da irradiazione al DNA, considerato la principale “molecola bersaglio” per vari effetti, come: – – – – – – –

Ritardo di divisione cellulare Morte cellulare Anomalie cromosomiche Mutazioni genetiche radioindotte Cancerogenesi da radiazioni Teratogenesi Riduzione della durata della vita 21

Alterazioni del DNA indotte da radiazioni • L’assorbimento di radiazioni provoca tre principali tipi di danno nel DNA: – Rottura della catena singola – Rottura della catena doppia – Distruzione di basi

• Tali danni possono essere riparati con tre principali modalità: – Riparazione per asportazione – Riparazione post-replicazione – Meccanismi di riparo della catena doppia.

• Il danno al DNA può essere riparato ad opera degli enzimi: endonucleasi, polimerasi, esonucleasi, ligasi. 22

-Riparazione del danno al DNArottura della catena singola e doppia

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Danno da radiazioni alle strutture cellulari • Si tratta di fenomeni difficilmente quantificati, che mostrano radiosensibilità variabile delle strutture considerate, a confronto con il nucleo. • In particolare devono essere tenute presenti le seguenti strutture: – – – –

Membrane cellulari Reticolo endoplasmico Lisosomi Mitocondri

• La sensibilità cellulare alle radiazioni dipende dal danno al DNA, ma anche a tutte le strutture cellulari nel loro insieme. Ciò spiega l’andamento complesso di molte curve dose-effetto. 24

Effetti delle radiazioni a livello cellulare • La perdita della capacità replicativa cellulare (morte riproduttiva) è il principale effetto considerato per valutare il rapporto con la dose. • Per cellule non divisibili, altissime dosi possono determinare cessazione del metabolismo e disintegrazione cellulare. • I parametri più frequentemente studiati sono la capacità di formare colonie (metodo di Puck) e la capacità di incorporare la timidina triziata (3HTdR), espressione della sintesi del DNA. • Con la curva dose-effetto e con l’equazione che la descrive viene studiata “in vitro” la radiosensibilità cellulare. 25

Tecnica di Puck (valutazione “in vitro” della radiosensibilità cellulare)

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Curve di sopravvivenza semplici (virus)

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Curve di sopravvivenza semplici (enzimi)

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Curve di sopravvivenza semplici (batteri)

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Curve di sopravvivenza per cellule di mammifero (1)

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Curve di sopravvivenza cellulare • In generale, la curva dose-effetto presenta andamento esponenziale, descritta mediante equazione del tipo seguente: N = N0 e –k/D k = 1/D0 N0: numero di cellule iniziali, N: cellule indenni dopo la dose D k: costante di pendenza della curva D0 o D37: dose che riduce al 37% le cellule sopravviventi • Questo andamento, valido per i virus, presuppone che il “bersaglio” sensibile della cellula venga inattivato da un solo urto e che non vi sia riparazione del danno. • La maggior parte dei batteri e delle cellule di mammifero presentano curve più complesse, bifasiche, con spalla continua, che indicano riparazione del danno per le dosi più basse. 31

Curve di sopravvivenza per cellule di mammifero (2)

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Modelli teorici per curve di sopravvivenza • Modello semplice (urto singolo) N = N0 e –D/D0 indica inattivazione casuale di una frazione costante delle cellule, dose costante.

a

• Modello a bersaglio multiplo f = 1 –1(1-e D/D0) N f: frazione sopravvivente N= numero di estrapolazione

il danno da basse dosi può essere riparato e pertanto la curva presenta una spalla iniziale

• Modello lineare quadratico (curvatura continua) f: = e (αD + βD2) Basse dosi: dipendenza dalla dose Alte dosi: dipendenza dal quadrato della dose. 33

Curve doseeffetto: modelli matematici della risposta cellulare.

34

Cellule di mammifero: variazioni della sensibilità con il ciclo cellulare

35

Sensibilità cellulare: rapporti con il tipo di radiazione

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Sensibilità cellulare: carenza di enzimi di riparazione del DNA

37

Sensibilità cellulare: effetto ossigeno e rapporto con il LET

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Sensibilità linfocitaria in malattie autoimmuni: colture di linfociti totali (PBL) stimolate con PHA (a 12 ore)

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Effetti genetici delle radiazioni ionizzanti - Aspetti qualitativi • L’irradiazione di una cellula in replicazione causa rotture cromosomiche o cromatidiche in funzione della fase del ciclo. • Le alterazioni cromosomiche fondamentali sono: – Interscambi per lesioni su cromosomi diversi – Interscambi nell’ambito di uno stesso cromosoma • Interbraccia, fra braccia opposte • Intrabraccia, sullo stesso braccio

• Discontinuità o rotture del cromosoma • Le aberrazioni cromosomiche si riscontrano p.es. nelle mappe cromosomiche di soggetti con esposizione alle radiazioni per motivi professionali. 40

-Riparazione del danno al DNAAberrazioni cromosomiche indotte da radiazioni

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Effetti genetici delle radiazioni - Aspetti quantitativi -

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Induzione del cancro da radiazioni - Aspetti generali 1• I primi casi di cancro da radiazioni sono stati osservati nelle mani di molti ricercatori che utilizzarono radium e raggi X. • Studi sperimentali mostrano che l’esposizione a radiazioni determina aumento dell’incidenza i tumori “spontanei”. • Il tempo di latenza, per tumori umani, è sempre lungo, anche di 30 – 40 anni in alcuni casi. • I tumori radio-indotti possono interessare quasi tutti i tessuti, a differenza degli agenti chimici. 43

Induzione del cancro da radiazioni - Aspetti generali -2 • L’efficacia nell’indurre neoplasie è maggiore per radiazioni ad alto che a basso LET. • Le neoplasie compaiono nei tessuti esposti alla radiazione, ma in alcuni casi sembra esservi un effetto indiretto. • Molti aspetti non sono completamente chiariti, come l’efficacia di basse dosi, caratteristiche della contaminazione ambientale. • Per una valutazione del rischio oncogeno sono disponibili dati sperimentali sull’animale e dati epidemiologici umani. 44

Induzione del cancro da radiazioni - curve dose-risposta -

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Induzione del cancro da radiazioni - dati sperimentali sull’animale -

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Induzione del cancro da radiazioni -dati sperimentali in vitro-

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Induzione del cancro da radiazioni - dati sperimentali sull’animale -

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INDUZIONE DEL CANCRO DA RADIAZIONI DATI EPIDEMIOLOGICI UMANI

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INDUZIONE DEL CANCRO DA RADIAZIONI DATI EPIDEMIOLOGICI UMANI

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Induzione del cancro da radiazioni - Dati epidemiologici umani Armi nucleari

Sopravvissuti alla bomba atomica (Hiroshima e Nagasaki) Esperimenti: Abitanti delle isole Marshall Altri “fallout”

Radioterapia medica

Spondiliti Altri processi non maligni, p. es. a carico della pelvi e del cuoio capelluto

Diagnostica medica

Radioscopia Thorotrast Pelvimetria (feto)

Esposizioni professionali

Minatori dell’urano e di altri minerali Verniciatori di quadranti di orologi. Radiologi. Addetti all’industria nucleare

Ambiente naturale

Aree di elevato fondo naturale

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-Induzione del cancro da radiazioni – Dati epidemiologici umani Fonti delle stime di rischio per varie neoplasie radioindotte Leucemia

Tiroide

Mammella

Polmone

Osso

Giapponesi sopravvissuti alla bomba atomica

+

+

+

+

-

Abitanti delle isole Marshall Pazienti sottoposti a radioterapia Diagnostica medica

-

+

-

-

-

+++

++

+

+

+

-

-

+ -

+ -

+ +

Minatori dell’uranio Verniciatori di quadranti di orologi

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Meccanismi della cancerogenesi da radiazioni (1) • Attivazione di oncogeni cellulari  L’attività di un gene può essere alterata in vari modi dalla traslocazione cromosomica sia in rapporto con la dose che con il LET.  La coincidenza di punti di rottura di specifiche aberrazioni cromosomiche con la localizzazione degli oncogeni cellulari umani può essere un meccanismo della cancerogenesi da radiazioni.  Resta da dimostrare se esiste un parallelismo fra aumento di aberrazioni cromosomiche specifiche da radiazioni ed incidenza di neoplasie maligne.  Le attuali osservazioni indicano che, p. es. nella trasformazione maligna di fibroblasti sono coinvolti almeno due geni posti su cromosomi differenti. 53

Meccanismi della cancerogenesi da radiazioni (2) • L’applicazione della teoria del bersaglio delle radiazioni può rivelarsi utile nell’indagine sul numero, la localizzazione e la distribuzione dei bersagli coinvolti nella trasformazione. • L’iniziazione è un pre-requisito, ma non sempre conduce al cancro. Alcune neoplasie maligne da radiazioni si manifestano solo nell’età di maggiore frequenza spontanea, per fattori dell’ospite. • Conosciamo poco di quanto accade nel periodo di latenza. Cellule neoplastiche possono restare silenti per anni, oppure il cancro po’ essere il risultato di mutazioni e selezioni successive. • In specifici tumori i fattori dell’ospite sono i più importanti e determinanti (es. meccanismi 54 immunitari).