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COMUNICACIÓN

Actividad de γ-glutamil-transpeptidasa en leche de camélidos sudamericanos Medina, Mirta 1 ; Silvia Saad 1 ; Karina Cansino

2 y

Francisco M. Fernández

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Facultad de Ciencias Naturales e IML, U.N.T. INTA Abra Pampa, Jujuy. 3 Instituto de Fisiología Animal, Fundación Miguel Lillo. Miguel Lillo 205, Tucumán. [email protected] 1 2

“ γ -glutamyl-transpeptidase activity in milk of South American camelids”. K EYWORDS : milk, γ -glutamyl-transpeptidase, camelids. P ALABRAS CLAVE : leche, γ -glutamil-transpeptidasa, camélidos.

En trabajos anteriores se ha comprobado la asociación existente entre la actividad de γ-glutamil-transpeptidasa (GGT) y los compartimientos de la secreción láctea en doce especies de mamíferos de nuestra fauna sudamericana (Saad et al., 2002; Saad y Fernández, 2002). En los mencionados trabajos no estaban incluidos datos referentes a los camélidos sudamericanos. Investigaciones llevadas a cabo recientemente permitieron ampliar la lista de animales estudiados con los representantes regionales de esta Familia. Es propósito del presente trabajo determinar: a) la actividad de GGT en el lactosuero (LS) de de las cuatro especies, llama, alpaca, guanaco y vicuña; b) la actividad total y por compartimiento en leche de guanaco y vicuña; c) el Km en vicuña y guanaco. Por razones derivadas de la cantidad de muestra, no se determinaron en llama y alpaca, las correspondientes actividades totales, ni se establecieron los K m . Para determinar la actividad de la citada enzima se utilizó un kit de Laboratorios Wiener (Argentina) que se basa en el método cinético de hidrólisis del sustrato γ-glutamil-p-nitroanilida, leyéndose espectrofotométricamente la cantidad de p-nitroanilina liberada. El K m se determinó mediante el método de Cleland (Henderson, 1998). Se utilizaron animales pertenecientes al INTA Abra Pampa (Jujuy), a criadores particulares de los Valles Calchaquíes y al Parque Fitozoológico Carlos Pellegrini de San Pedro de Colalao. Cabe aclarar que las muestras de alpaca corresponden a un

animal descendiente de un híbrido con un porcentaje de sangre de llama inferior a un 12,5%. Los resultados encontrados en LS mostraron los siguientes valores de actividad de GGT: llama 185 U/L; alpaca 517 U/L; guanaco 790 U/L; vicuña 540 U/L. La actividad de la enzima en los distintos compartimientos en guanaco y vicuña, mostró que el primero posee una actividad de 1090 U/L asociada a los glóbulos grasos y caseínas, lo cual equivale a un 58% del total y a un 42% en el LS, que corresponde a lo mencionado en el párrafo anterior. Para la vicuña, se observó una actividad de 540 U/L asociada a los glóbulos grasos y caseínas, que corresponde a un 50% del total y el 50% restante corresponde a la actividad en el LS. La determinación del Km de la GGT en el lactosuero dio los siguientes resultados: guanaco 40 μM y vicuña 36,5 μM. En relación a los K m medidos en el compartimiento de glóbulos grasos, mostraron valores similares a los obtenidos en lactosuero. De hecho, el método de Cleland para determinación del Km se basa en la identificación del valor de la mediana entre un conjunto de valores, cada uno de los cuales corresponde a la intersección de dos líneas que representan concentración y velocidad inicial. Estos valores no tienen una distribución normal. A partir de ello el tratamiento estadístico no paramétrico de los dos conjuntos de valores, con los cuales se determina el Km (por ejemplo “vicuña” y “guanaco”), demostró que no difie-

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M.

Medina

et

al.: Actividad

de

ren significativamente (p = 0,25). De la misma forma no hay diferencias significativas entre los datos utilizados para la determinación de los Km entre GGT extraída de glóbulos grasos y GGT del lactosuero, como ya se ha mencionado. El hecho que exista pequeña (o nula) diferencia entre los valores de Km de dos especies pertenecientes a esta Familia no es de extrañar, dado que la separación entre estas taxas parece ser relativamente reciente en los camélidos sudamericanos (Clutton-Brock, 1999). Por otra parte observaciones llevadas a cabo sobre pesos moleculares y concentraciones absolutas de lactoproteínas en las cuatro especies mencionadas, demostraron que la similitud entre ellas es altísima (Medina et al., 2003). De todas formas la diferencia observada entre los Km de vicuña y guanaco, aunque modesta, merece comentario. En primer lugar se debe mencionar el hecho que existen dos Km. Uno corresponde a la hidrólisis del grupo glutamilo del resto de la molécula, generalmente glutatión, ó γglutamil-p-nitroanilida, para el caso del método de determinación utilizado, quedando el glutamilo provisoriamente unido a la enzima. El otro Km corresponde a la transpeptidación de este grupo hacia el aceptor, la glicilglicina en los métodos de determinación. Numerosos trabajos han demostrado la influencia de otros compuestos sobre la velocidad de la enzima y del K m. Por ejemplo, los ácidos biliares, como el colato y el deoxicolato, disminuyen el Km y aumentan la velocidad de la hidrólisis mientras que algunos conjugados, como el taurocolato y el glicocolato, actúan de forma contraria (Abbot y Meister, 1983). Cabe aclarar que es bastante difícil establecer comparaciones entre los valores de K m mencionados en distintos trabajos, con frecuencia la información de diversos autores corresponde a mediciones llevadas cabo en diferentes condiciones. Por ejemplo, en varios trabajos en los que se mide el Km, la solubilización de la enzima se efectúa mediante proteólisis del sector hidrofóbico de la subunidad mayor que permite su inserción en la

γ-glumatil-transpeptidasa

en

leche

de

camélidos

membrana celular. En consecuencia, las determinaciones no se realizan con la enzima completa. De la misma manera, en la generalidad de los casos, hay diferencias en cuanto a la concentración de componentes de los ensayos, a la temperatura utilizada, etc (Miller et al., 1976; Karp et al., 2001; Stole et al., 1994). A lo expresado hay que agregar que un gran número de ensayos se llevan a cabo, y en forma creciente, con animales o células transgénicas (Carter et al., 1997; Harding et al., 1997; Habib et al., 1996), los cuales muestran numerosas discrepancias con los tipos salvajes. Otro aspecto que impide hacer comparaciones rigurosas a partir de los antecedentes de la bibliografía, lo constituyen los propios métodos para establecer el Km, los cuales en general están muy expuestos a la influencia de valores atípicos en los puntos que generan las pendientes, y en consecuencia producen leves diferencias que distorsionan los resultados. A partir de lo expuesto se concluye que: 1) las diferencias observadas entre los Km de las especies estudiadas, no representarían diferencias biológicas reales; 2) la enzima presente en el glóbulo graso es la misma que la existente en el LS en cuanto a las características cinéticas y 3) casi con seguridad, ambas son homólogas y ortólogas entre sí. BIBLIOGRAFÍA Abbott, W. A. & A. Meister. 1983. Modulation of gamma-glutamyl transpeptidase activity by bile acids. Journal of Biological Chemistry, 258: 6193-6197. Carter, B. Z.; A. L. Wiseman; R. Orkiszewski; K. D. Ballard; C. N. Ou & M. W. Lieberman. 1997. Metabolism of leukotriene C4 in gamma -glutamyl transpeptidase-deficient mice. Journal of Biological Chemistry, 272: 12305-12310. Clutton-Brock, J. 1999. A natural history of domesticated mammals. Cambridge University Press. Cambridge, U. K. 320 pgs. Habib, G. M.; R. Barrios; Z. Z. Shi & M. W. Lieberman. 1996. Four distinct membrane-bound dipeptidase RNAs are differentially expressed and show discordant regulation with gamma -glutamyl transpeptidase. Journal of Biological Chemistry, 271: 16273-16280. Harding, C. O.; P. Williams; E. Wagner; D. S. Chang; K. Wild; R. E. Colwell & J. A. Wolff. 1997.

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137 Miller, S. P.; Y. C. Awasthi & S. K. Srivastava. 1976. Studies of human kidney gamma-glutamyl transpeptidase. Purification and structural, kinetic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry, 251: 2271-2278. Saad, S.; F. M. Fernández; M. Uhart; M. Lewis; C. Campagna; M. Medina & A. Vila. 2002. Primer estudio comparativo de γ -glutamiltransferasa en leche de mamíferos y su relación con el tenor graso. Acta zoológica lilloana, 47 (1): 85-91. Saad, S. & F. Fernández. 2002. Lactoserum γ -glutamyltransferase activity. Comparative aspects. Biocell, 26 (1): 176 (Comunicación). Stole, E.; T. K. Smith; J. M. Manning & A. Meister. 1994. Interaction of gamma-glutamyl transpeptidase with acivicin. Journal of Biological Chemistry, 269: 21435-21439.