147354571 Anemia Defisiensi Besi Ppt

C.

Metode titrasi, melalui ekstraksi memakai alat perforator (khusus untuk contoh-Contoh yang bemama). '

Cara kerja:

1) 2) 3) 4) 5) 6) 7)

8) 9)

Hubungkan erlenmeyer bertutup asah yang berisi batu didih dengan perforator.

Timbang 5 gram contoh yang telah dihomogenkan, tambah 5 ml HCl 25° 0, aduk rata.

Masukkan ke dalam perforator dengan menggunakan corong bertangkai panjang bila contoh berserat saring dengan kapas.

Bilas corong dengan air panas, cairan contoh diusahakan tidak melebihi dari 1/3 tinggi isi perforator.

Panaskan di atas pemanas listrik dan ekstraksi selama 6 jam, kemudian dinginkan. :

Pindahkan lapisan benzen. ke dalam erlenmeyer dengan cara mendorongnya dengan air yang diisi melalui mulut perforator.

Pindahkan lapisan benzen dalam labu kocok, tambah 25 ml air dan kocok sampai bebas asam.

Pindahkan benzen ke dalam erlenmeyer asal.

Tambah beberapa tetes fenolftalein (pp) dan titer dengan NaOI 0,1 N. Dada Gambar 2.3 terlihat kmmalogmm slamlardari asam bcnzom di antara asam sm'bal dan mc!iI-phidroksihcimial. pada Gambar 3.4 terlihat kmmalugram pada sari lmahjcruk yang mengandung & ppm asam benzoat. asam surhal (» ppm molil-p-hiclroksibcnzoan Dari Gambar 2.4 dapal diidcnlilikasikan terhadap kronuuogram Mandar bcnmxarkan waktu tambal (RI) (Ii Gambar 2.3. Perhitungan: Kadarasam benzoal sampel dihitung menggunakan kurva kalibrasi dcngan penamaan garis lurus y = ax l b. kemudian dihilung kadar benzoat sebagai garam.

b. Asam Sorbut dan Gammnya 1. Kualimli/"(IloomJ.. and Flores, JD. 1981;AOAC, 1995)

fl.

Cam dcslilasi uap. diekstraksi dalam clcr dari larulan asam dan ekstrak diperiksa dengan UV alau TLC.

C am kerja:

Timbang sebanyak 25-50 gram sampel dan destilasi melalui dcslilasi uap dengan menambah sebelumnya 100 mg magnesium sulfat dan 100 ml HZSO4 1M,1akukan dcstilasi selama 30 menit sehingga didapat 450 ml yang ditampung dalam labu yang mengandung 10 ml larutan natrium hidroksida ! M. Panaskan labu yang mengandung sampel sehingga dihasilkan wama. Tambahkan 15 ml HZSO4 I M dan deslilal dilarutkan sampai 500 ml, masukkan 100 ml ekstrak (dcslilal) dalam 25 ml dietileter dalam masingmasing 3 labu crlenmeyer dan diekstrak, hasil ekstrak digabung dan dicuci dengan akuadcs dan dikeringkan dengan NaZSO4, kemudian dievaporasi sehingga volume menjadi sedikit. Sebanyak 20 mikroliler atau kurang dilololkan pada plat thin layer chromatography (TLC) silika gel dcngan pcmbanding asam sorbat mumi. Sebagai fase gerak campuran clanoI-amonia dan batas elusi 10 cm. Keringkan dan semprot dengan pereaksi 2lhiobarbitural 1,25% dipanaskan selama 5 menit pada 100°C, timbul wama pink pada spot di TLC. Bandingkan harga Rfdari sampel dan pembanding. Kerok kromatogram pada TLC di alas dan diukur dengan spektrum serapan ultraviolet dengan melarutkan dalam isopropanol (] dalam 400.000) menunjukkan maksimum pada panjang gelombang 254 nm & 2 nm.

spesifikasi berdasarkan puncak dan waktu relensi (Rt) pada HPLC. 2.

Ix'uu/III/u/(‘l'Uloon. J., and Flores, J.D., 1981; AOAC, 1995; SNI, 1979; dun SIIl I973)

(l.

Titrasi volumclri

Tilrasi saksama kromatogram yang telah dikcrok lcbih kurang 10 mg larulkan dalam 10 ml metanol dan air 10 ml, yang sebelumnya telah (linclralkan dcngan NaOll 0,02 N. Tambahkan fenolptalein dan titrasi dcngan NaOH 0,1N sampai terjadi warna merah muda yang stabil selama lak kurang dari 30 dctik.

Perhitungan: lml Na011 0,1N setara dengan 1 1,21 mg asam sorbat.

Mctodc spektrofotometri

Metode ini dapat digunakan untuk produk ternak yang segar, keju

mozzarclla, krem asam, dan yoghurt.

Pereaksi dan alat:

1) Larutan asam metafosfor: 5 gr HPOJ dalam 250 ml air dan dilarutkan sampai 1 liter dengan alkohol.

2) Larutan KMnO4: larutkan 15 g KMnO4 dalam air sampai 100 ml dan saring dengan gelas wool.

3) Larutan asam sorbat untuk stok: 1 mg/ml dilarutkan 200 mg asam sorbat dalam 200 ml campuran eter(petr01eum eter: eter anhidrat

= l : l) (1).

4) Larutan kerja: 0,05 mg/ml, larutkan 10 ml larutan stok sampai didapat 200 ml dengan campuran eter(11).

5) Larutan referensi: kocok 100 ml campuran eter tadi dengan 10 ml larutan HPO1 dan keringkan supernatan larutan eter dengan 5 gr Na3804 anhidrat.

6) Alat Spektrofotometer UV.

Kurva standar:

Tambahkan 1, 2, 4, dan 6 ml larutan kerja (1) pada labu ukur 100 ml dan encerkan sampai volume dengan campuran eter. Pemeriksaan A dari larutan campuran ini pada panjang gelombang 250 nm. Plot A sebagai mg asam sorbat/ 100 ml.

Cara kerja:

Ditimbang dengan saksama sebanyak 10 gram sampel dan diblender. Tambahkan larutan HPO3 sehingga didapat 100 ml larutan campuran. Blender 1 menit dan saring dengan kertas saring Whatman No. 3. Baru! .snmpcl &" 0,250 g

|:nklm' pengenceran = I00 kuli

Luas puncnk sampel = 62450

Konsentrasisnmpcl = y

154951xI4033

x _ 62450 -l4033 15495|

= 0,3I2mg/L

ii

Kadar asam bcn70at: w: 12,48 mg L

2,50

Unluk clucn metanol-buffer posfal (isokralik), yang digunakan unluk pangan padat dan larutan (cair):

Sampe] cairan langsung dianalisis, sedangkan yang padat dipersiap_ kan dahulu kemudian dianalisis, dengan cara:

a) Larutan standar

b)

25 mg asam benzoat mumi dilarutkan dalam 25 ml metanol sampai 50 ml dalam labu ukur. Untuk larutan standar kerja (B) dibuatperbandingan l : 10.

Langsung dianalisis

Untuk minuman sari buah, sepeni sari jeruk, anggur, dan minuman lainnya. Di sini tidak perlu di clean up. Dalam hal ini dilakukan penyaringan dengan mikrofiller ukuran 0,45 mikrometer (A). Limit deteksi asam benzoat yang mempunyai koefisien absorpsi paling kecil dan senyawa yang dianalisis jauh di bawah konsentrasi normal yang digunakan dalam

pangan.

Taklangsung

Sampel yang mengandung trigliserida atau matriks yang sejenis seperti mentega, terlebih dahulu sampel seperti margarin diekstraksi dengan cara melarutkan sebanyak 5 gram dalam 50 ml dietileter dan diekstraksi dua kali dengan 10 ml 0,1 N. Ekstrak dengan dasar air diasamkan dengan linl H2804 5 N dalam labu volumetri dan dilarutkan sampai volume dengan metanol (A).

Cam penerapan: Larutan A dan B disuntikkan secara terpisah dan dilakukan anahs'xs

dcngan kromatografi cair kinerja tinggi dengan kondisi: Kolom : p-Bondapak C ! 8.

Dclcktor : UV panjang gelombang 235 nm. Fase mobil : Metanol pro HPLC dan buffer yang disaring dcngan membran mikrofnltcr tipe HVLP 0,45 um

(Buffer fosfat: 2,5 gram KZHPOQHEO pa dan 2,5 gram KHZPO4 dalam air bidestmata), vo\ume

penyuntikan: 10 ul ~20 ul. Mctodc 11PLC(Pcrfetti, el al., 1981, AOAC, 1995)

Elucn asam asetat _inethanol, seperangkat IIPLC dcngan kolom H~ Bondapak CN waters dan jenis Detektor UV dengan panjang gelombang yang bervariasi.

Pereaksi:

Asam benzoat, metanol pro H PLC, asam sitrat, dan asam asetat glacial.

Pcrsiapan conloh:

1) Contoh bentuk padat atau semipadat

Homogenkan contoh yang berupa padatan atau semipadat(ha1us_ kan). Pindahkan 150 ml atau 150 gram kc dalam 500ml, tambahkan NaCl jenuh secukupnya, buat alkalis terhadap kertas lakmus dengan larutan NaOH 10% atau dengan suspensi Ca(OH)2 (] bagian Ca(OH)2 dalam 3 bagian air). Enccrkan sampai tanda dengan larutan NaCchnuh, kocok berulang kali. Biarkan selama 2jam, kocok berulang kali dan saringjika contoh mengandung banyak lemak, bagian yang saringannya terkontaminasi oleh lemak ditambahkan beberapa ml larutan NaOH 1000 ke dalam saringan_ Ekstraksi dcngan eter sebelum dilanjutkan ke cara kerja.

2) Kecap Tambahkan 15 gram NaCl halus ke dalam labu ukur 500 ml, bilas dengan larutan jenuh NaCl 150 ml. Buat larutan sedikit alkalis terhadap lakmus dengan penambahan NaOH 1000, enccrkan dengan NaCljenuh sampai tanda batas biarkan selama 2jam dan

kocok berulang kali. Saring dengan kain kasa.

Cara kerja:

1) Persiapan analisis Khusus untuk contoh beberapa jus/sari buah atau sejenisnya, saring terlebih dahulu dengan membran filter dan cnccrkan

secukupnya dengan larutan asam sitrat 1%.

2) Persiapan standar Buat larutan masing-masing 6,9] mg asam benzoat dengan asam sitrat 1% dalam labu ukur 50 ml.

3) Encerkan larutan di atas sebanyak 15 kali, 12 kali, 10 kali, 8 kali, 6 kali, 4 kali, hingga diperoleh konsentrasi yang berbeda untuk

kalibrasi. 4) Buat kurva kalibrasi dengan menyuntikkan 10 p.! larutan standar dari scliap konsentrasi yang berbeda.

Kondisi kromatografi:

Kolom : u-Bondapak CN waters dan sejenisnya Eluen : Asam asetat 2°o metanol (95:5) chepatan alir eluen : 1,5 ml/menit

Detektor : UV bervariasi

Perhitungan:

Hitung luas puncak kromatogram dan plotkan terhadap konsentrasi pada kurva kalibrasi dengan menggunakan persamaan garis lurus y = ax + b, kemudian hitung kadar benzoatjuga garamnya.

A . . I I I _ __,_4 J,l__.L_L__ ..”-AA... C.

Perhitungan:

Asam benzoat (…g/kg) = V x N >< 122 >< 1 000 W W = Bobotcuplikan

N = Nonnalitas NaOH

V : Volume NaOH 0,1 N yang diperlukan untuk pentiteran contoh (ml)

Spektrofotometri UV (AOAC,1995; SN], 1992; su, 73 dan 79)

Dlpergunakan untuk produk tomat, jam, jeli, minuman ringan yang mengandung sejumlah alkohol, minuman ringan, sari buah, dan tidak

untuk produk padat. Cara kerja: 1) Homogenkan dulu sampe], lalu transfer 10 gram atau 10 ml pada

corong pemisah dan larutkan dalam larutan NaCl jenuh. Larutan dibuat asam dengan menambah larutan HCl 0,1o o. Siapkan larutan asam benzoat dalam eter yang mengandung 20; 40; 60; 80; 100; dan 120 mg/l. Lakukan pemeriksaan absorbans (A) dari larutannya pada panjang gelombang di antara interval 265 280 nm pada tiap satu interval. Plotkan antara A (absorbans) terhadap

konsentrasi.

2) Ekstraksi sampel dengan 70, 50, 40, dan 30 ml bagian eter, kocok

dan pisahkan bagian eter, cuci dengan HCl 0,1" 0 dan ambil ekstrak etemya. Kemudian ekstraksi lagi bagian eter dengan NH4OH 0,100 dan buang bagian etemya. Gabungkan ekstrak amonia ini dan netralkan dengan HCl. Larutan asam ini diekstrak lagi dengan 70, 50,40, dan 30 ml eter. Setelah dipisah, ekstrak eter dilarutkan dengan eter sampai mencapai volume 200 ml dan diukur absorbannya, kemudian diplotkan dengan kurva standar untuk menentukan kadar asam benzoatnya. Untuk garamnya, hitung berdasarkan berat molekul.

Kromatografi gas (AOAC, 1995) Dipergunakan untuk sari apel, pasta almond, ikan, makanan yang kaya protein dan karbohidrat.

Cara kerja: 1) Buat larutan standar asam benzoat dengan konsentrasi 200, 400,

600, 800, dan 1.000 pg ml. 2) Persiapan sampel: homogenkan sampel dengan penghomogen mekanik sampai homogen.

3) Ekstraksi: masukkan sebanyak 5 gram sampel homogen dalam tabung sentrifus 30 ml larutan standar internal (250 mg asam pcnilasetal dan 250 mg asam kaproat dalam 100 ml larutan KOH air 3°o); 1,5 IIZSOJ (l : 5), 5 gr pasir dan 15 ml eter. Kocok dengan pengocok mekanik selama 5 menit, sentrifus selama 10 menit pada 1500 kali gravitasi. Pindahkan lapisan eter dengan pipet dalam labu pemisah 250 ml. Ulangi ekstraksi dua kali. Fase eter digabung dua kali dari ekstraksi tadi, digabung dan ditambah 15 ml 0,5N NaOH dan 10 ml larutan NaCl jenuh. Lapisan air masukkan dalam labu pemisah 250 ml, tambahkan 2 pengujian metil orange dan diasamkan sampai pH 1 dengan HCl (1 : 1), ekstrak dengan CI-IzCl2 75, 50 dan 50 ml, kocok. Bila emulsi terbentuk, tambah 10 ml NaCl jenuh. Keringkan ekstrak CHZC 1 2 dengan penyaring yang mengandung 15 gram NaISO4 anhidrat dalam botol beralas dan evaporasi pada 40°C.

4) Derivatisasi dan lakukan kromatografi gas

Tambahkan sebanyak 10 ml CHC 13 dalam hasil evaporasi dalam

labu bulat tadi, kocok 2 menit. Transfer 1 ml CHC 13 dalam tabung

reaksi 8 ml yang mempunyai penutup teflon, kemudian 0,2 ml

silylating agent, sumbat labu dan panaskan di oven atau direndam dalam penangas air selama 60 menit, injeksikan secara duplo dalam kromatografi gas. Ukur puncak tertinggi perbedaan antara 2 puncak duplo sekitar < 5° 0, plot berat vs masing-masing puncak tertinggi.

Perhitungan: Asam benzoat (mg kg) = ( y-a)/b >< (W” x W) x 1.000 = Inlerscp b = Slop kurva standar y = Perbandingan masing-masing puncak asam benzoat/standar intemal

W = Berat sampel WII Kemudian dihitung kadar sebagai garam

N

Berat standar internal dalam mg 2.

1.

Kondisi kmmamgmt'n:

a.

HPLC yang dipakai dari Water Association Inc (Milford, M.A) yang dilengkapi dengan injektor Model U6K dengan 20 111 sampcl kmi). permalir pelan]! Model 6000A, detektor spectrometer Model 450_ Absorbami diatur pada panjang gelombang 214 nm dan 135 nm. Fase mobil: 0.400 larutan 05% (w/v) (Nl-14):HPO4 dalam air dan asctonitri1.yang pH-nya diatur menjadi 2,24 dengan 1131304. Kecepatan nlimn fase mobil: 1,2 ml/mcnit pada suhu kamar.

Kolom Backman C-S Ultra sphcrcoctyl dengan partikel berukuran 5 pm dan ukuran kolom 250 >< 4,6 mm dipakai untuk pemisahan.

Baik pelarut maupun larutan standar disaring melalui 0,2 pm dan 0,45 um penyaring membran (Sartorius SM 1 1607, SM 1 1606).

Perhinmgan:

Kadar asam propionat dalam sampel dihitung menggunakan kurva kalibrasi dengan persamaan garis lurus: y = ax + b. Kemudian dihitung kadar propionat sebagai garamnya.

Ester Asam Benzoat Kualitatif dan Kuantitatif

Metode kromatografi cair kinexja tinggi (HPLC) (SNI, 1992; SII, 1979; Farmakope Indonesia, 1995; Perfetti, et al., 1981).

Prinsip : Sampel diasamkan dan diekstraksi dengan dietil eter. Ekstrak

eter dipekatkan kemudian diujikan pada TLC, lalu dilihat penampakan dengan menggunakan penyinaran UV atau reagen

Deniges.

Alat : Tabung pemisah.

Pereaksi:

a. PelarutTLC, yaitu toluen: metanol: asam asetat = 90 : 16 : 8.

b. 2% larutan dalam eter dari metil, etil, dan propil p-OH benzoat.

c. Reagen Deniges: campuran 5 gr merkuri oksida kuning dalam 40 ml air, dinginkan dalam es atau garam dan pelan-pelan tambahkan asam sulfat pekat, diputar dan ditambah air 40 ml.

d. Asam sulfat 10%.

Larutan NaNO2 2% segar. Plat TLC silica gel. Kurvn Slnndnr:

Pipcl I ; 2: 3: 4; dun 5 ml larutan metil dan propil p-hidroksibcnzoat (500 ug/ ml musing-maeingnyn). Lnrulknn sampai volume dalam labu ukur l00 ml. Kocok sampai larut. Hasilnya menunjukkan macingmasing konsentrasi standar 5, [0, 15, 20, dan 25 pg mclil dan propil p-hidroksibcn/oat per ml.

Ekstraksi sampel:

Sebanyak 20 gram daging dihaluskan. Timbang saksama 2 gram dan masukkan dalam tabung sentrifus I5 ml dan tutup. Tambahkan 5 ml asctonitril dan kocok 30 detik. Sentrifus dengan kecepatan 500 rpm selama 5 menit. Dekantasi supematan dalam botol volumetn' 25 ml. Cukupkan volume dcngan asetonitril.

Pengukuran:

a. Larutan slandar: suntikkan 10 ul aliquot masing-masing standar pada HPLC.

b. Larutan sampel: suntikkan 10 ul aliquot masing-masing standar pada HPLC.

Kondisi HPLC:

Fase mobil : 45% asetonitril dalam air (v/v). Flow rate : 1,4 ml/menit.

Suhu : Kamar.

Detektor : UV pada 254 nm.

Perhitungan:

Paraben, ppm (pg/g) = (C x 25)/W

C = konsentrasi, pg paraben/ml ekstrak sampel

25 = ml akhir ekstrak W = berat'(g) dari sampel daging yang diekstrak Pada Gambar 2.7 terlihat kromatogram dari daging yang diberi pengawet

metil atau propil-p-hidroksibenzoat (A) dan daging yang tidak diberi pengawet. c. Potasinm Sorbat Metode HPLC (Hoon, J., and Flores, J.D., 1981; AOAC, 1995)

Sampel: Daging babi yang diasinkan

Cara kerja:

Sebanyak 20 25 gr sampel yang ditimbang saksama dimasukkan dalam labu 250 ml. Sebanyak 100 ml aquabidestilata, kemudian dihomogenkan dan disentrifuge seterusnya disaring dengan membran mikrof'llter 0,2 pm.

Cara penetapan: Larutan A dan B disuntikkan secara terpisah dan dilakukan analisis dengan kromatogfafl cair kinerja tinggi dengan kondisi:

Kolom : C18. Detektor : UV panjang gelombang 225 nm. Fase mobil : 1-13PO4 0,01M 77% dan asetonitril 23° o.

Volumepenyuntikan : 10111…

Perhitungan:

Kadar potassium sorbat dalam sampel dihitung menggunakan standar interval dan kurva kalibrasi dengan persamaan garis lurus: y = ax + b, dari konsentrasi sorbat vs ketinggian puncak.

d. Asam Propionat dan Garamnya 1. Kromalograji Gas (KingkateAmara, e!a1., 1981 dan AOAC, 1995) Alat : Kolom gelas ukuran diameter 2 mm x 4 m yang berisi 5% Carbnowax 20 m/Gas chrom Q (mesh 80100). Suhu : Oven/kolom 125°C, injeksi: 220“C, deteklor: 250°C. Gas : nitrogen 1,6 bar; udara 3 bar; hidrogen 2,8 bar.

Bahan : Larutan baku: sejumlah 50 mg asam propionat yang ditimbang saksama dilarutkan dalam 50 ml etil asetat. Dibuat sejumlah larutan baku seri yang mengandung 0,2 ; 0,4 ; 0,6 ; dan 0,8 ug/ ml dalam etil asetat. Cara kerja:

Sejumlah 5 gram sampel ditimbang saksama dan masukkan dalam blender, ditambah 1 ml asam fosfat pekat, 10 gr NaZSO4 anhidrat, dan 50 ml etil asetat. Blender 5 menit, lapisan atas diambil dan disaring masukkan dalam labu ukur 100 ml. Sisa dalam blender, lapisan atas dipisahkan, disaring dan dicampur dengan larutan dalam labu ukur tadi dan tambah etil asetat hingga tanda batas (larutan uji), setelah itu disuntikkan ke alat kromatografi masingmasing larutan baku dan uji.

Perhitungan:

Kadar asam propionat (sebagai garamnya) dalam sampel dihitung dengan rumus:

Kadar asam propionat = Lu/Lb x Bb/Bu >< F

Lu = Luas kromatogram larutan uji

Lb = Luas kromatogram larutan baku

Bb = Bobot baku propionat yang disuntikkan (mikrogram)

Bu = Bobot penimbangan sampel

F = Volume akhir larutan uji/volume larutan uji yang disuntikkan {100

x 1.000/111L} Kromatografi cair kinerja tinggi (AOAC, 1995) Preparasi sampel:

a. Sampel yang dapat dianalisis dengan cara ini adalah berbagai produk susu, keju, yogurt, begimjuga susu segar.

b. Kecuali susu segar, preparasi produk lainnya sama, yaitu 7 gram sampel ditambahkan ke dalam 50 ml buffer asetonitril (yang di gunakan untuk

fase mobil). Untuk susu segar 10 ml ditambahkan ke dalam 40 ml fase mobil.

c. Buffer asetonitril dibuat dengan mengatur pH 0,40 0 larutan asetonitril (v/v) dalam 0,50 0 (w/v) larutan (NHJZHPO4 dalam air dengan H31304 sehingga pH-nya 2,24.

d. Campuran yang dihasilkan dihomogenasi dan diekstraksi selama l jam. Seterusnya disentrifus pada 7.000 x G selama 5 menit.

e. Supematan yang dihasilkan disaring sekali melalui kertas saring dan dua kali melalui penyaring membran (Sartorius SM l 1606) berukuran 0,45 um.

f. Sebanyak … mikroliter hasil saringan diinjeksikan langsung ke dalam kromatograf dengan menggunakan 25 ul syringe Hamilton. Metode kromatografi cair kinerja tinggi (Hoon, J., and Flores, J.D_ l93LAOAC, 1995) Dengan eluen asam asctat-metanol

Alat : Seperangkat HPLC dengan kolom u-Bondapak CN Waters atau sejenis. Detektor UV dengan panjang gelombang bervariasi.

Pereaksi : Asam sorbat, metanol, pro HPLC, asam sitrat, dan asam asetat glasial.

Persiapan contoh:

1) Contoh bentuk padat atau semipadat Homogenkan contoh yang berupa padat atau semipadat (haluskan). Pindahkan 150 ml atau 150 gram ke dalam labu 500 ml, tambahkan NaCl jenuh secukupnya, buat alkalis terhadap kenas lakmus dengan penambahan NaOH 10% atau dengan suspensi Ca(OH)2 (l bagian Ca(OH)2 dalam 3 bagian air). Encerkan sampai tanda dengan larutan NaCl jenuh, kocok berulang kali. Biarkan selama 2 jam dan kocok berulang kali. Jika contoh mengandung banyak lemak, bagian yang saringannya terkontaminasi oleh lemak ditambahkan beberapa ml NaOH 10% ke dalam saringan. Ekstrak dengan eter sebelum dilanjutkan ke cara kerja.

2) Kecap Tambahkan 15 gram NaC1ha1us ke dalam labu ukur 500ml, bilas dengan larutan jenuh NaCl 150 ml. Buat larutan sedikit alkalis terhadap kertas lakmus dengan penambahan NaOH 10%, encerkan dengan larutan NaCl jenuh sampai tanda batas. Biarkan selama 2jam dan kocok berulang kali. Saring dengan kain kasa.

3) Jeli, jam, dan mannalad

Hancurkan 150 mg contoh di dalam 300 ml larutan NaCl jenuh. Tambahkan 15 gr NaCl yang telah dihaluskan. Buat alkalis terhadap kertas lakmus dengan suspensi Ca(OH)2. Pindahkan ke labu ukur 500 ml dan encerkan dengan NaCl jenuh. Biarkan 2 jam, kocok berulang kali, sentrifus, dan jika perlu disaring.

4) Sari apel yang mengandung alkohol dan produk yang sama

Buat 150 ml contoh menjadi alkalis terhadap lakmus dengan NaOH 10° 0 dan uapkan pada penangas air sampai 100 ml. Pindahkan ke 5)

labu ukur 250 ml tambahkan NaCl jenuh. Biarkan selama 2jam dan kemudian kocok berulang kali dan saring.

ikan asin atau ikan yang dikeringkan

Cuci 50 gram contoh yang telah dihaluskan ke dalam labu ukur 500 ml. Buat sedikit alkalis terhadap lakmus dengan NaOH 10% dan encerkan sampai batas volume dengan air. Biarkan selama 2 jam dan kemudian berulang kali dikocok dan saring. Pipet sebanyak mungkin bagian saringan yang diukur (300 ml) ke labu ukur 500 ml kedua dan tambahkan 30 gram NaCl yang telah dihaluskan untuk setiap 100 ml

larutan. Kocok sampai NaCl larut, encerkan dengan larutan NaCl jenuh. Kocok sampai homogen, saring protein/ bahan lain yang mengendap.

Cara kerja:

a.

Persiapan analisis

Khusus untuk contoh beberapa jus/sari buah atau sejenisnya,

saring terlebih dahulu dengan membran dan encerkan secukupnya dengan larutan asam sitrat 1%.

Persiapan standar

Buat larutan masing-masing 4,93 mg asam sorbat dengan asam sitrat 1% dalam labu ukur 50 ml.

Encerkan larutan di atas sebanyak 15x, 12x, 10x, 8X, 6x, 4x hingga diperoleh konsentrasi yang berbeda untuk kalibrasi.

Buat kurva kalibrasi dengan menyuntikkan 10 ul larutan standar dari setiap konsentrasi yang berbeda.

Kondisi kromatografi:

Kolom : p Bondapak CN waters dan sejenisnya. Eluen : Asam asetat 2° o/metanol (95:5). Kecepatan alir eluen : 1,5 mi/menit.

Detektor : UV bervariasi.

Perhitungan:

Kadar asam sorbat dalam sampel dihitung menggunakan kurva kalibrasi

dengan persamaan garis lurus: y = ax + b, kemudian dihitung kadar sorbat sebagai garam. Cam penetapan: Larutan A dan B disuntikkan secara terpisah dan dilakukan analisis

dengan HPLC pada kondisi: : Oktadcsilsilana pada partikel 10 um/S um;

Kolom 4,6 X 15 cm. Detektor : UV panjang gelombang 22511111. Fase mobil : Metanol pro HPLC dan buffer fosfat yang

disaring dengan membran mikrofllter tipe HVLP 0,45 um (buffer fosfat: 2,5 gram KZHPO4.3HZO pa dan 2,5 gram KHZPO4 dalam air bidestillata).

Volume penyuntikan : 10 ul 20 ul. Laju alir : 1 ml/menit.

Perhitungan: Kadar asam sorbat dalam sampel dihitung menggunakan kurva kalibrasi dengan persamaan garis lurus y = ax + b, kemudian hitung kadar sorbat

sebagai garam. Kromatografi cair kinerja tinggi cara isokratik (Hoon, J., and FloreS, J.D., 1981;AOAC, 1995)

Digunakan untuk pangan padat dan larutan (cair). Sampel cairan langsung dianalisis, sedangkan yang padat dipersiapkan

dahulu kemudian dianalisis.

Cara kerja: 1) Larulan standar: 20 mg asam sorbat mumi dilarutkan dalam 25 ml metanol sampai 50 ml dalam labu ukur. Untuk larutan standar

kerja (B) dibuat perbandingan 1 : 10. 2) Langsung dianaIisis: untuk minuman sari buah, seperti sari jeruk, anggur, dan minuman lainnya. Di sini tidak perlu di clean up. Dalam hal ini dilakukan penyaringan dengan mikrofllter ukuran 0,45 mikrofilter (A). Limit deteksi asam benzoat yang mempunyai koefisien absorpsi paling kecil dari senyawa yang dianalisis jauh di bawah konsentrasi nonnal yang digunakan dalam pangan.

3) Tak langsung Sampel yang mengandung trigliserida atau matriks yang sejenis seperti mentega. Terlebih dahulu sampel seperti margarin diekstraksi 5)

labu ukur 250 ml tambahkan NaCl jenuh. Biarkan selama 2jam dan kemudian kocok berulang kali dan saring.

Ikan asin atau ikan yang dikeringkan

Cuci 50 gram contoh yang telah dihaluskan ke dalam labu ukur 500 ml. Buat sedikit alkalis terhadap lakmus dengan NaOH 10% dan encerkan sampai batas volume dengan air. Biarkan selama 2 jam dan kemudian berulang kali dikocok dan saring. Pipet sebanyak mungkin bagian saringan yang diukur (300 ml) ke labu ukur 500 ml kedua dan tambahkan 30 gram NaCl yang telah dihaluskan untuk setiap 100 ml larutan. Kocok sampai NaCl larut, encerkan dengan larutan NaCl jenuh. Kocok sampai homogen, saring protein/ bahan lain yang mengendap.

Cara kerja:

a.

Persiapan analisis

Khusus untuk contoh beberapa jus/sari buah atau sejenisnya, saring terlebih dahulu dengan membran dan encerkan secukupnya dengan larutan asam sitrat 1°o.

Persiapan standar

Buat larutan masing-masing 4,93 mg asam sorbat dengan asam sitrat l°o dalam labu ukur 50 ml.

Encerkan larutan di atas sebanyak 15x, 12x, 10x, 8x, 6><, 4>< hingga di peroleh konsentrasi yang berbeda untuk kalibrasi.

Buat kurva kalibrasi dengan menyuntikkan 10 ul larutan standar dari setiap konsentrasi yang berbeda.

Kondisi kromatografi:

Kolom : p. Bondapak CN waters dan sejenisnya. Eluen : Asam asetat 2° o/metanol (95:5). Kecepatan alir eluen : 1,5 ml/menit.

Dctektor : UV bervariasi.

Perhitungan:

Kadar asam sorbat dalam sampel dihitung menggunakan kurva kalibrasi dengan persamaan garis lurus: y = ax + b, kemudian dihitung kadar sorbat sebagai garam. Cam penetapan: Larutan A dan B disuntikkan secara terpisah dan dilakukan analisis

dengan H PLC pada kondisi: : Okladesilsilana pada pariikci IO pm/S pm;

Kolom 4,6 X 15 cm. Detektor : UV panjang gelombang 225nm. Fase mobil : Metanol pro HPLC dan buffer fosfat yang

disaring dengan membran mikrofilter tipe HVLP 0,45 um (buffer fosfat: 2,5 gram KZHPO4.3HZO pa dan 2,5 gram KHZPO4 dalam airbidestillata).

Volume penyuntikan : 10 ul 20 ul.

Laju alir ! ml/menit.

Perhinmgan: Kadar asam sorbat dalam sampel dihitung menggunakan kurva kalibrasi dengan persamaan garis lurus y = ax + b, kemudian hitung kadar sorbat

sebagai garam. Kromatograti cair kinerja tinggi cara isokratik (Hoon, J ., and Flores, J.D., 1981; AOAC, 1995)

Digunakan untuk pangan padat dan larutan (cair).

Sampel cairan langsung dianalisis, sedangkan yang padat dipersiapkan

dahulu kemudian dianalisis.

Cara kerja:

I ) Larutan standar: 20 mg asam sorbat mumi di larutkan dalam 25 ml metanol sampai 50 ml dalam labu ukur. Untuk larutan standar kerja (B) dibuat perbandingan ] : 10.

2) Langsung dianalisis: untuk minuman sari buah, seperti sari jeruk, anggur, dan minuman lainnya. Di sini tidak perlu di clean up. Dalam hal ini dilakukan penyaringan dengan mikrofilter ukuran 0,45 mikrofilter (A). Limit deteksi asam benzoat yang mempunyai koefisien absorpsi paling kecil dari senyawa yang dianalisis jauh di bawah konsentrasi normal yang di gunakan dalam pangan.

3) Taklangsung Sampel yang mengandung trigliserida atau matriks yang sejenis

seperti mentega. Terlebih dahulu sampel seperti margarin diekstraksi dengan cara melarutkan sebanyak 5 gram dalam 50 ml dietileter dan diekstraksi dua kali dengan IO ml O,! N. Ekstrak dengan dasar air diasamkan dcngan I ml HZSO‘ SN dalam labu volumetri dan dilarutkan sampai volume dcngan metanol (A).

Cara penctapan: Larutan A dan B disuntikkan secara terpisah dan dilakukan kromatografi cairan kinerja tinggi dengan kondisi:

Kolom : u-Bondapak C18.

Detektor : UV panjang gelombang 235 nm.

Fase mobil : Metanol pro HPLC dan buffer fosfat yang disaring dengan membran mikrofllter tipe HVLP 0,45 um (Buffer fosfat: 2,5 gram KZHPO4.3H20 pa dan 2,5 gram KHIPO4 dalam air bidestillata).

Volume penyuntikan : 10 pl -20 ul.

Pada Gambar 2.5 terlihat puncak kromatogram asam sorbat standar

yang mempunyai Rt (waktu tambat) dengan asam sorbat yang diperlakukan pada sampel (Gambar 2.6). Transfer 10ml filtrat pada corong pemisah 250ml yang mengandung 100 mlcampuran eter(pclr01eum eter: eter anhidrat= 1 : 1)dan kOCOk 1 menit. lapisan air dibuang dan lapisan eter diekstrak dengan 5 gr M12804 anhidrat. Ukur pada panjang gelombang 250nm untuk larutan

referens.

Hitung konsentrasi asam sorbat dcngan kurva standar!

Persentase asam sorbat = (mg asam sorbat/g sampel) x (1/1.000 mg) >< 100 = mg asam sorbat/ 10. Kemudian hitung garamnya.

Untuk konfirmasi adanya asam sorbat:

Tambahkan 2 ml larutan KMnQ pada sisa larutan eter dan kocok 1 menit. Saring dengan kemas Whatman No. 3 dan tambahkan 5 gr NaZSO4 anhidrat, kocok dan ukur larutan pada panjang gelombang 300 220 nm untuk mengkonfnmwsi bahwa adanya asam sorbat dalam sampel,

Kromatografi gas (AOAC, 1995) Dipergunakan untuk sari apel, pasta almond, ikan, pangan yang kaya protein, dan karbohidrat.

Caranya: 1) Buat larutan standar: 200, 400, 600, 800, dan 1.000 mikrogram/ml

asam sorbat. 2) Persiapan sampel: homogenkan sampel dengan penghomogen

mekanik sampai homogen.

3) Ekstraksi: sebanyak 5 gr sampel dihomogenkan masukkan dalam tabung sentrifus 30 ml larutan standar internal (250 mg asam penilasetat dan 250 mg asam kaproat dalam 100 ml larutan KOH air 3%); 1,5 ml H2804 (1 : 5), 5 gr pasir, dan 15 ml eter.

4) Kocok dengan pengocok mekanik selama 5 menit dan sentrifus

selama 10 menit pada 1.500x gravitasi. Transfer lapisan eter dengan pipet da1am labu pemisah 250 ml. Ulangi ekstraksi dua kali. Fase eter ekstraksi dua kali tadi digabung dan ditambah 15 ml 0,5N NaOH dan 10 ml larutan NaCl jenuh. Lapisan air masukkan dalam labu pemisah 250 ml, tambahkan 2 pengujian metil orange dan diasamkan sampai pH 1 dengan HC1 (1 : 1). Lalu ekstrak dengan CHZCI2 75, 50, dan 50 ml. Kocok dan bila emu1si terbentuk tambahkan 10 ml NaCl j enuh. Keringkan ekstrak CHZCI2 dengan penyaring yang mengandung 15 gr Nast4 anhidrat dalam botol beralas bulat dan evaporasi pada 40°C. d.

5) Dcrivulisnsi dan lakukan kromatografi gas Tambahkan sebanyak IO ml CHCIx dalam hasil evaporasi dalam labu bulat tadi dan kocok 2 mcnit. Transfer l ml CHCIx dalam tabung rcaksi 8 ml yang mempunyai penutup tcflon, kcmudian tambah 0,2 ml si/yluling agent, sumbat labu dan panaskan di oven atau rendam dalam pcnangas air selama 60 menit. lnjcksikan secara duplo dalam kromatografi gas. Ukur puncak tertinggi. Perbedaan antara dua puncak duplo sekitar < 5° 0. Plot konsentrasi (x) vs masingmasing puncak tertinggi (y).

Perhitungan: Asam sorbat (mg/kg) = [(y a)/b] X (W”/W) x 1.000

a = intersep

b = slop kurva standar

y = perbandingan masing-masing puncak asam sorbat/ standar internal

W = berat sampel

W” = berat standar internal dalam mg

Kemudian hitung kadarasam sorbat sebagai garam.

Kromatografl cair kinerja tinggi (HPLC), (Hoon, J., and Flores, J.D., 1981 , and AOAC, 1995)

Metode ini digunakan untuk penetapan sorbat di dalam saus tomat dan sambal.

Prosedur:

Larutan uji

Sejumlah lebih kurang 5 gram cuplikan ditimbang saksama, kemudian dimasukkan ke dalam labu terukur 50 ml diencerkan dengan larutan metanol 60% sampai tanda batas. Kemudian disaring menggunakan kertas milipor 0,2 pm dan dihawaudarakan (A).

Larutan baku

Sejumlah masing-masing 60 mg garam natrium atau kalium sorbat ditimbang saksama dan dimasukkan ke dalam labu terukur 50 ml, dilarutkan dalam metanol 60° 0, dan diencerkan sampai tanda. Dengan larutan metanol 60o o dibuat masing-masing satu seri larutan baku yang dipipet berturut-turut 0,5; 1; 2; 3; 4; dan 5 ml ke dalam labu terukur 50 ml dan diencerkan dengan air sampai tanda (B).

Metode kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) (Perpetti. e! al., 1981) Metode ini digunakan untuk penetapan kadar nipagin (mclil-p. hidroksibcnzoat) dan nipasol (propil-p-hidroksibenzoat) dalam sari buah.

.)

...

a.

Cara kenja: Larutan uji: sejumlah lebih kurang 5 g cuplikan ditimbang saksama,

dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, dienccrkan dengan larutan metanol 60% sampai tanda dan disaring. Sejumlah 5 ml f'nltrat dipipel, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, dienccrkan dcngan metanol 60% sampai tanda dan disaring menggunakan filter (diameter 0,45 um) (A)

Larutan baku: sejumlah masing-masing 50 mg nipagin BP dan nipasol BP ditimbang saksama, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, dilarutkan dalam metanol 60% dan diencerkan sampai tanda. Dengan larutan ini dibuat satu seri larutan baku yang dipipet berturut-turut 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0 ml, diencerkan dengan metanol 60% sampai

tanda (B).

Cara penetapan:

Larutan A dan B disumikkan secara terpisah dan dilakukan analisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi pada kondisi sebagai berikut. : Oktadesilsilana(RP-18), ukuran partikel silika

Kolom 5 pm, 4,6 mm x 150 mm. Fase gerak : Mctanol-dapar fosfat (60 : 40).

Laju aliran : 1,2 ml per menit.

Detektor : Ultraviolet pada panjang gelombang 254 nm. Volume penyuntikan : 10 ul.

Panjang gelombang : 254 nm.

Kadar nipagin dan nipasol dalam cuplikan masing-masing adalah:

Lu Bb

x ->< F

Lb Bu Lu = Luas puncak nipagin atau nipasol larutan uji Lb = Luas puncak nipagin atau nipasol larutan baku Bb = Bobot baku yang ditimbang

Bu = Bobotcuplikan yang ditimbang F = Faktor pengenceran

Penetapan kadar nisin

Kualitatif:

a. Senyawa diekstraksi dengan pelarut organik dan dibakar untuk timbulnya bau yang spesifik.

b. Dibandingkan dengan standar, mengenai waktu retensinya pada HPLC.

Kuantitatif(secara mikrobiologi):

Sampel yang sudah digems halus diasamkan pada pH 2,5; diekstraksi dengan pelarut organik. Kemudian dari fase pelarut organik dievaporasi.

Setelah itu dilakukan uji menggunakan mikroba uji. Mikroba uji: Micrococcus luteus ATCC 10240 Medium:

Agar medium A (Antibiotik Medium l)

Gelatin (digest pankreatik dari gelatin) : 6 gram Casein (digest pankreatik dari kasein) : 4 gram

Ekstrak ragi : 3 gram

Ekstrakdaging : 1,5 gram

Glukosa anhydrous : 1 gram

Agar : 15 gram : 1 liter

Air suling sampai Dunasak sampai homogen dan berwamajemih sampai pH 6, 5 6 6 3 .

Disten'lisasi dalam auroklafselama I 5 menit. Cara kerja:

a. M ikroba uji diremajakan terlebih dahulu selama 48 jam,

b. Lamtkan residu dalam air suling steril dan pengujian pada kerta saring yang berbentuk bulat diameter 6 mm dan telah stem Sekitas 5 ul. tanamkan pada 20 ml medium agar yang telah membek r dalam cawan pem' dan telah digores dengan mikroba uji. InkUbasl-J selama 24 -48 jam. Kalau teg’adi hambatan, ukur zona hambat: (mm). Buat juga standar nisin yang dibuat dengan herba

. . a' konsentrasz dalam mrkroler. g '

c. Dengan menggunakan kurva kalibrasi dapat ditentukan Potens' dari nisin dalam sampe]. 1