128114128_full.pdf

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR BROMELAIN TERHADAP BOVINE SERUM ALBUMIN (BSA) DARI EKSTRAK KULIT BUAH NANAS (Ananas comosus (L.) Merr)

SKRIPSI Diajukan untuk memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh : Yohanes Bintang Pambudi NIM : 1281141128

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2017

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR BROMELAIN TERHADAP BOVINE SERUM ALBUMIN (BSA) DARI EKSTRAK KULIT BUAH NANAS (Ananas comosus (L.) Merr)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana (S. Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Yohanes Bintang Pambudi NIM: 128114128

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2017

i

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

“Segala perkara dapat kutanggung di dalam Dia yang memberi kekuatan kepadaku” Filipi 4:13

When we pray, God hears more than we say, answer more than we ask, gives more than we imagine.. In His time and His own way.

Dipersembahkan untuk Gusti Yesus Kristus, Bunda Maria, Keluarga, orang-orang terkasih yang telah membantu secara moral dan materi. Dan bagi yang merasa bahwa karya ini berguna

iv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PRAKATA

Puji dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan

segala

rahmat

dan

karunia-Nya

sehingga

penulis

dapat

menyelesaikan skripsi yang berjudul ” Uji Aktivitas Antioksidan dan Penetapan Kadar Bromelain Terhadap Bovine Serum Albumin (BSA) Dari Ekstrak Kulit Buah Nanas (Ananas comosus L. Merr)” sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Dalam menyelesaikan skripsi ini penulis mengalami banyaknya kesulitan dan hambatan. Keberhasilan penulis dalam penyusunan skripsi ini tentunya tidak terlepas dari dukungan, bantuan, nasehat, bimbingan, kritik dan saran dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan tulus dan kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si, Apt., selaku dosen pembimbing atas bimbingan, arahan, semangat, kritik dan saran selama penyusunan proposal hingga selesainya skripsi ini. 3. Bapak Maywan Hariono, Ph.D, Apt., selaku dosen penguji atas, arahan, kritik dan saran atas skripsi ini. 4. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku dosen penguji atas, arahan, kritik dan saran atas skripsi ini.

vii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

5. Segenap dosen Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, yang telah membagikan ilmu selama penulis menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi. 6. Segenap staf laboratorium, staf kebersihan, dan staf keamanan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Terutama Pak Wagiran, Pak Musrifin, Pak Parlan dan Mas Kunto yang telah banyak membantu kelancaran penelitian. 7. Richard Andrison Sadeli, teman seperjuangan skripsi, atas kerjasama, dukungan, semangat, dan masukan yang diberikan. 8. Teman-teman penghuni dan ibu Kost DMP atas dukungan dan semangatnya. 9. Teman, sahabat tempat bertukar pikiran dan kegembiraan serta kesusahan (Sarjo, Putra, Indra, Fofo, Gotaro, Jabon, Budi) atas kebersamaan dan dukungan. 10. Teman-teman FSM C, FST B, Mas Boy 2012 dan Farmasi angkatan 2012 atas kebersamaan, kerjasama, dan kenangan selama di Fakultas Farmasi. 11. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. Seperti pepatah, “tak ada gading yang tak retak”, demikian juga penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna dan masih memiliki banyak kekurangan dan kesalahan mengingat keterbatasan kemampuan dan pengalaman yang dimiliki dan dialami oleh penulis. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis sangat mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak untuk kebaikan bersama di kemudian hari. Akhir

viii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

kata, penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan masyarakat.

Yogyakarta, 15 Juni 2016

Penulis

ix

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL........................................................................................

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN ..........................................................................

iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................

iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..........................................................

v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................

vi

PRAKATA .......................................................................................................

vii

DAFTAR ISI ....................................................................................................

x

DAFTAR TABEL ............................................................................................ xiv DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xvi INTISARI......................................................................................................... xvii ABSTRACT ....................................................................................................... xviii BAB I. PENGANTAR .....................................................................................

1

A. Latar belakang ....................................................................................

1

1. Rumusan masalah .........................................................................

4

2. Keaslian penelitian .......................................................................

4

3. Manfaat penelitian ........................................................................

5

B. Tujuan penelitian ................................................................................

5

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA..............................................................

6

A. Nanas ..................................................................................................

6

1. Klasifikasi tumbuhan ....................................................................

6

x

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

2. Morfologi ......................................................................................

6

3. Kandungan kimia ..........................................................................

7

B. Bromelain. ..........................................................................................

7

C. Radikal Bebas .....................................................................................

8

D. Antioksidan .........................................................................................

8

1. Definisi antioksidan ......................................................................

9

2. Uji aktivitas antioksidan ...............................................................

9

3. Penggolongan antioksidan ............................................................

10

E. Spektrofotometri UV-Visibel .............................................................

11

F. Metode DPPH .....................................................................................

12

G. Landasan Teori ...................................................................................

12

H. Hipotesis .............................................................................................

14

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN .......................................................

15

A. Jenis dan rancangan penelitian ...........................................................

15

B. Variabel dan definisi operasional .......................................................

15

1. Variabel utama ..............................................................................

15

2. Variabel pengacau ........................................................................

15

3. Definisi operasional ......................................................................

16

C. Bahan penelitian .................................................................................

17

D. Alat penelitian.....................................................................................

17

E. Tata cara penelitian .............................................................................

17

1. Determinasi buah nanas ................................................................

17

2. Pengumpulan buah nanas .............................................................

18

xi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

3. Pembuatan ekstrak kulit buah nanas ............................................

18

4. Analisis kualitatif ..........................................................................

19

5. Penetapan kadar enzim bromelain ................................................

19

6. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan .................................

21

7. Uji aktivitas antioksidan ..............................................................

22

F. Analisis hasil.......................................................................................

23

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................

26

A. Hasil determinasi buah .......................................................................

26

B. Hasil pengumpulan bahan ..................................................................

26

C. Hasil preparasi sampel ........................................................................

27

D. Hasil uji pendahuluan .........................................................................

29

1. Uji ninhidrin .................................................................................

29

2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan ..........................................

31

E. Hasil penetapan kadar enzim bromelain terhadap BSA ....................

32

F. Hasil optimasi uji aktivitas antioksidan ..............................................

37

1. Penentuan Operating Time (OT) ..................................................

36

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λ maks) ........................................................................................

35

G. Hasil uji aktivitas antioksidan.............................................................

38

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ..........................................................

46

A. Kesimpulan .........................................................................................

46

B. Saran ...................................................................................................

46

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................

47

xii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

LAMPIRAN .....................................................................................................

52

BIOGRAFI PENULIS .....................................................................................

80

xiii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR TABEL Tabel I.

Hasil pengukuran absorbansi kadar enzim bromelain terhadap BSA .............................................................................

34

Tabel II.

Hasil penetapan kadar enzim bromelain terhadap BSA ............

35

Tabel III.

Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum DPPH .........................................................................................

38

Tabel IV.

Hasil aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH .............

41

Tabel V.

hasil aktivitas antioksidan ekstrak bromelain kulit buah nanas dengan metode DPPH ................................................................

Tabel VI.

42

Hasil hasil perhitungan IC50 rutin dan ekstrak bromelain Kulit buah nanas .........................................................................

xiv

43

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR GAMBAR Gambar 1.

Reaksi ninhidrin dengan protein ................................................

30

Gambar 2.

Hasil uji ninhidrin .....................................................................

30

Gambar 3.

Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan ..............................

32

Gambar 4.

Kurva persamaan regresi linear Bovine Serum Albumine (BSA) ................................................

33

Gambar 5.

Kurva penentuan Operating Time (OT) rutin ............................

37

Gambar 6.

Reaksi antara senyawa antioksidan dengan DPPH....................

39

Gambar 7.

Kurva persamaan regresi linear rutin.........................................

40

Gambar 8.

Kurva persamaan regresi linear ekstrak kulit buah nanas .........................................................................

xv

42

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi buah nanas (Ananas comosus L. Merr) ........................................................

52

Lampiran 2. Gambar buah nanas ..................................................................

53

Lampiran 3. Perhitungan rendemen ...............................................................

54

Lampiran 4. Penimbangan analisis kualitatif .................................................

55

Lampiran 5. Data penimbangan penetapan kadar bromelain terhadap BSA ..........................................................................................

55

Lampiran 6. Optimasi penetapan kadar bromelain terhadap BSA .................

56

Lampiran 7. Penetapan kadar bromelain terhadap BSA ................................

59

Lampiran 8. Penimbangan pengujian aktivitas antioksidan ...........................

63

Lampiran 9. Perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding dan larutan uji ............................................................................

64

Lampiran 10. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan.................................

67

Lampiran 11. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH .............

71

Lampiran 12. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak kulit buah nanas .........................................................................

73

Lampiran 13. Uji statistik .................................................................................

76

xvi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

INTISARI Kulit buah nanas (Ananas comosus L. Merr) memiliki kandungan senyawa protein proteolitik yang dapat berperan sebagai antioksidan. Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi radikal bebas dalam tubuh. Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kadar enzim bromelain dalam ekstrak kulit buah nanas dan menguji aktivitas antioksidan. Estimasi kadar bromelain ditentukan secara spektrofotometri dengan menggunakan standar Bovine Serum Albumine (BSA). Aktivitas antioksidan ditentukan dengan metode DPPH yang dinyatakan dalam IC50 (Inhibition Concentration 50). Penelitian menunjukkan bahwa estimasi kadar enzim bromelain yang dihitung terhadap BSA dalam ekstrak kulit buah nanas sebesar (7,8233 ± 0,1096) %. Aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah nanas yang dinyatakan dengan nilai IC50 sebesar (4869,3 ± 28,2744) μg/mL. Kata kunci : Ananas comosus L. Merr, aktivitas antioksidan, DPPH, bromelain, IC50

xvii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRACT Pineapple peels (Ananas comosus L. Merr) contain proteolytic protein that can act as antioxidant. Antioxidant is a compound that can inhibit the reaction of free radicals within the body. The aims of this study are to determine the concentration of total protein in pineapple peels extract and its antioxidant activity. The assay of total protein was determined by spectrophotometric with Bovine Serum Albumin (BSA) as the reference. Antioxidant activity was determined using DPPH radical scavenging method, expressed as IC50 (Inhibition Concentration 50). Results showed that the total protein concentration of the pineapple peels extract is (7,8233 ± 0,1096) % w/w. Furthermore, the antioxidant activity of bromelain from pineapple peels extract is found weak with the IC50 value (4869,3 ± 28,2744) μg/mL. Keywords: Ananas comosus L. Merr, antioxidant activity, DPPH, total protein, IC50

xviii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Pada masa modern penyakit degeneratif semakin banyak berkembang. Penyakit degeneratif seperti kanker, diabetes, CHD (Cardiovascular Heart Disease), disfungsi otak dan penuaan dini sering dikatikan dengan adanya kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas (Ames, Shigenaga, dan Hagen, 1993). Radikal bebas merupakan suatu senyawa yang mempunyai elektron bebas tidak berpasangan. Hal inilah yang menjadikan senyawa radikal bebas bersifat sangat reaktif dan tidak stabil. Karena ketidakstabilannya tersebut, senyawa radikal bebas akan segera menyerang komponen seluler yang berada di sekitarnya, seperti lipid, karbohidrat, protein maupun asam lemak. Radikal bebas melakukan reaksi oksidasi patogenik terhadap sel atau komponennya, sehingga dapat menyebabkan disfungsi sel, kerusakan struktur sel atau mutasi yang berakibat pada timbulnya penyakit degeneratif (Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2001). Efek dari radikal bebas dapat dihentikan dengan adanya antioksidan. Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghentikan reaksi berantai radikal bebas dengan bekerja sebagai pendonor elektron. Oleh karena itu antioksidan dapat mengurangi terjadinya kerusakan sel-sel tubuh. Senyawa antioksidan dapat diperoleh dari senyawa-senyawa metabolit sekunder tanaman yang mempunyai struktur cincin aromatis fenol atau senyawa fenolik. Cincin

1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2

aromatis fenol inilah yang akan berkontribusi terhadap aktivitas antioksidan (Winarsi, 2007). Senyawa antioksidan sintetik seperti butylated hydroxyanisole (BHA), propyl gallate (PG) dan butylated hydroxytoluene (BHT) telah banyak digunakan secara luas selama beberapa waktu. Akan tetapi, terdapat kemungkinan senyawa antioksidan sintetik tersebut mempunyai efek toksik dan karsinogenik. Oleh karena itu dilakukan eksplorasi senyawa antioksidan yang baru, aman dan efektif dari alam yang diambil dari berbagai tanaman. Banyak penelitian telah menunjukkan bahwa senyawa antioksidan dari tanaman tersebut cukup efektif dalam menghambat terbentuknya radikal bebas (Zou, Lu, dan Wei, 2004; Azlim et al., 2010) Nanas merupakan tumbuhan yang hidup di daerah tropis. Nanas mengandung berbagai senyawa seperti vitamin C (Gardner et al., 2000), asam ferulat, asam kafeat, dan p-asam hidroksibenzoat (de Simon et al., 1992; van Lelvveld dan de Bruyn, 1977), serta bromelain. Bromelain dapat ditemukan di berbagai bagian tanaman nanas, seperti daging, stem, dan kulit. Bromelain merupakan golongan enzim protease yang mampu memecah protein rantai panjang menjadi fragmen protein yang lebih kecil bahkan sampai ke bentuk asam amino (Ali, Milala, dan Gulani 2015). Enzim protease dapat meregenerasi jaringan yang terluka dan mencegah timbulnya keloid. Pembentukan keloid disebabkan karena adanya akumulasi dari jaringan kolagen dan pembentukan jaringan pyridinoline yang diasosiasikan dengan radikal bebas. Beberapa enzim protease yang digunakan dalam perawatan luka adalah papain dan bromelain (Pendzhiev, 2002).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 3

Untuk melihat potensi antioksidan dari enzim protease yang telah digunakan dalam perawatan luka, dalam penelitian ini dilakukan pemeriksaan aktivitas antioksidan terhadap kulit buah nanas. Berbagai penelitian telah membuktikan bahwa kulit nanas mempunyai kemampuan sebagai antioksidan dan aktivitas biologis lainnya (Hossain dan Rahman, 2011; da Silva et al, 2010; Erukainure et al, 2012). Kulit dari buah nanas merupakan salah satu bagian dari limbah buah nanas, selain bonggol dan daunnya. Limbah tersebut umumnya dapat digunakan sebagai pakan ternak. Khususnya kulit buah nanas dapat digunakan untuk produksi kertas, baju, dan uang kertas. Hal tersebut disebabkan kulit buah nanas banyak mengandung selulosa, hemiselulosa, dan karbohidrat yang lain (Bartholomew et al., 2003). Bromelain diduga terkandung dalam kulit, selain di bonggol, dan daun (Ketnawa, Rawdkuen, dan Chaiwut, 2010). Penelitian aktivitas antioksidan ini dilakukan dengan metode DPPH (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl)

secara

kolorimetri

dengan

menggunakan

spektrofotometer pada daerah visibel. Metode DPPH dipilih karena sederhana, mudah, cepat, dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel. Parameter yang digunakan untuk uji penangkapan radikal DPPH adalah IC50 yaitu konsentrasi ekstrak yang dibutuhkan untuk menangkap radikal DPPH sebanyak 50% (Zou, Lu, dan Wei, 2004). Pengukuran konsentrasi protein total dari ekstrak kulit buah nanas dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri 280 nm yang merupakan salah satu metode yang cepat dan sederhana dalam menentukan protein total (Chaurasiya dan Hebbar, 2013).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 4

1. Rumusan Masalah a. Apakah ekstrak kulit buah nanas mempunyai daya antioksidan? b. Berapa nilai aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah nanas yang dinyatakan dengan IC50? c. Berapa kadar enzim bromelain dalam ekstrak kulit buah nanas yang dihitung terhadap BSA? 2. Keaslian Penelitian Sejauh penelusuran peneliti, penelitian yang serupa pernah dilakukan oleh Bresolin, Silveira, Tambourgi, dan Mazzola (2013) dengan judul “Isolation and Purification of Bromelain from Waste Peel of Pineapple for Therapeutic Application”. Penelitian ini menggunakan kulit buah nanas yang didapat di Campinas (Brazil), purifikasi dengan menggunakan metode presipitasi dengan amonium sulfat, dan pengukuran konsentrasi enzim menggunakan ion exchange chromatography. Selain itu penelitian serupa juga pernah dilakukan oleh Hatam, Suryanto, dan Abidjulu (2013) dengan judul “Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak Kulit Nanas (Ananas comosus (L.) Merr)”. Penelitia ini dilakukan menggunakan kulit nanas yang didapatkan di Bolaang Mongondow, Manado (Indonesia), ekstraksi menggunakan etanol 80% dan teknik maserasi, soxhlet dan refluks, dan penentuan aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl). Perbedaan penelitian ini dengan penelitian yang pernah dilakukan tersebut teletak pada tempat dimana buah nanas didapatkan, metode purifikasi, dan metode uji kualitatif dan penetapan kandungan bromelain. Penelitian ini menggunakan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 5

buah nanas yang diperoleh di Pasar Stan Maguwoharjo (Yogyakarta), purifikasi menggunakan etanol 95% dengan perbandingan 1:3 selama 24 jam, uji kualitatif menggunakan ninhidrin, dan pengukuran konsentrasi enzim menggunakan metode spektrofotometri 280 nm. 3. Manfaat Penelitian a. Manfaat Teoritis Penelitian ini

diharapkan dapat

menambah

perkembangan wawasan

pengetahuan khususnya dalam ilmu kefarmasian tentang aktivitas antioksidan dari ekstrak dari kulit buah nanas. b. Manfaat Praktis Penelitian ini diharapkan dapat menambah wawasan kepada masyarakat tentang aktivitas antioksidan dalam ekstrak kulit buah nanas sehingga kulit-kulit nanas hasil dari kupasan buah nanas dapat digunakan untuk pemeliharaan kesehatan.

B. Tujuan Penelitian 1. Untuk mengetahui daya antioksidan ekstrak kulit buah nanas. 2. Untuk mengetahui nilai aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah nanas yang dinyatakan dalam IC50. 3. Untuk mengetahui kadar protein total dari ekstrak kulit buah nanas yang dinyatakan dalam persentase (%).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Nanas 1.

Klasifikasi tumbuhan Divisi

: Spermatophyta

Sub divisi

: Angiospermae

Kelas

: Monocotyldoneae

Bangsa

: Bromeliales

Suku

: Bromeliaceae

Marga

: Ananas

Spesies

: Ananas comosus Merr. (Tjitrosoepomo, 1994; Backer dan van

Den Brink, 1963). 2. Morfologi Tanaman nanas berbentuk semak dan hidupnya bersifat tahunan. Susunan bagian tumbuhan nanas meliputi akar, batang, daun, bunga, buah, dan tunas. Berbiji tunggal. Bentuk batang nanas seperti gada, berukuran panjang antara 20-25 cm atau lebih, tebal dengan diameter 2,0-3,5 cm, beruas-ruas pendek. Tangkai bunga atau buah merupakan perpanjangan batang. Daun nanas tumbuh memanjang sekitar 130150 cm, lebar antara 3-5 cm atau lebih, bagian pinggir daun ada yang berduri dan tidak berduri, permukaan daun bagian atas halus berwarna hijau tua atau merah tua bergaris atau coklat kemerah-merahan. Daun mahkota berbentuk garis memanjang dengan panjang lebih kurang 2 cm, putih dan ungu, dari dalam dan pangkalnya dengan dua pinggiran yang menonjol, berkuku (Rukmana, 1996).

6

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 7

3. Kandungan kimia Nanas mengandung vitamin C (Gardner et al., 2000), asam ferulat, asam kafeat, dan p-hidroksi asam benzoat (de Simon et al., 1992; van Lelvveld dan de Bruyn, 1977), serta bromelain. Kulit nanas mengandung selulosa, hemiselulosa dan karbohidrat lain (Bartholomew et al., 2003).

B. Bromelain Bromelain merupakan enzim proteolitik yang didapat dari tanaman dengan family bromeliaceae, dimana yang paling banyak ditemukan terdapat pada buah nanas (Ananas comosus L. Merr). Penggunaan bromelain pada umumnya adalah sebagai agen anti-inflamasi, anti-edema, antitrombotik, dan aktivitas fibrinolitik (Manzoor, Nawaz, Mukhtar, dan Haq, 2016). Bromelain umumnya paling banyak ditemukan di bagian stem dan dagingnya. Oleh karena itu munculnya nama stem bromelain dan fruit bromelain dikarenakan enzim tersebut umumnya dapat ditemukan di bagian stem dan daging buah nanas (Maurer, 2001). Bromelain tersusun atas rantai tunggal polipeptida dengan 212 asam amino terlipat menjadi dua domain struktur yang stabil oleh jembatan disulfide dan ikatan hydrogen. Sisi aktif terletak di permukaan molekul di antara domain, dengan dua residu katalik, yaitu Cys25 dan His159 (Ishihara, Takahashi, Oguri, dan Tejima, 1979). Bromelain mempunyai bentuk serbuk amorf dengan warna putih bening sampai kekuning-kuningan, berbau khas, mempunyai kestabilan pada pH 5,0-7,0. Bromelain larut sebagian dalam eter dan aseton, dan mempunyai suhu optimal pada 50o C – 60o C (Maurer, 2001).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 8

Metode isolasi bromelain dapat dilakukan salah satunya dengan metode presipitasi. Metode ini dilakukan dengan penambahan pelarut organik seperti aseton, alkohol, dan amonium sulfat. Bromelain diisolasi dari bagian tanaman yang sudah berbentuk perasan atau sari buahnya dengan menambahkan pelarut organic sebagai bahan pengendap. Dalam beberapa penelitian ada yang menggunakan cara pengendapan yang berbeda, seperti melakukan pengendapan dengan penambahkan larutan pada pH tertentu dan perlakuan pada suhu tertentu (Maurer, 2001).

C. Radikal Bebas Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki sebuah elektron tak berpasangan pada jari-jari terluar dari atom. Sifatnya tidak stabil dan pada struktur biologis dapat menyebabkan kerusakan oksidatif (Chaisawvong dan Supapor, 2009). Radikal bebas dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid serta DNA, dan dapat menginisiasi timbulnya penyakit degeneratif (Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2007). Dalam rangka mendapatkan stabilitas kimia, radikal bebas memilik i kecenderungan untuk mencari pasangan. Radikal bebas akan menyerang molekul stabil yang terdekat dan mengambil elektron. Zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal bebas juga sehingga akan memulai suatu reaksi berantai yang akhirnya terjadi kerusakan sel (Winarsi, 2007).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 9

D. Antioksidan 1. Definisi antioksidan Antioksidan merupakan senyawa yang diperlukan tubuh menetralis ir radikal bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas terhadap sel normal, protein, dan lemak. Antioksidan memiliki berat molekul kecil akan menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas (Winarsi, 2007). Kebanyakan senyawa ini (misalnya tokoferol) digunakan sebagai pengawet dalam berbagai produk (misalnya dalam lemak, minyak dan produk makanan untuk menunda ketengikan dan perubahan-perubahan yang tidak diinginkan, dalam karet untuk menunda oksidasi). Pengertian antioksidan yang lebih relevan secara biologis ialah senyawa alami atau sintetik yang ditambahkan ke dalam produk untuk mencegah atau menunda kerusakan yang disebabkan oleh udara (Huang, Ou, dan Prior, 2005). 2. Uji aktivitas antioksidan Uji aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan beberapa metode, baik secara kuantitatif maupun kualitatif. Uji aktivitas antioksidan secara kuantit atif yang biasa dilakukan adalah dengan metode DPPH. Prinsip dari metode ini adalah penangkapan elektron bebas dari senyawa radikal bebas yang dapat menyebabkan adanya reaksi perubahan warna pada DPPH dari ungu menjadi kuning (Dephour, Ebrahimazedh, Fazel, dan Mohammad, 2009). Metode lain yang sering digunakan antara lain, metode Ferric-reducing antioxidant power (FRAP), Cupric ion reducing antioxidant capacity (CUPRAC), dan Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC). Selain itu uji aktivitas antioksidan secara kualitatif dapat

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 10

dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) atau dengan menggunaka n kromatografi kertas (Davidek, 1997). 3. Penggolongan antioksidan Menurut sumbernya, antioksidan dapat digolongkan menjadi dua macam, yaitu antioksidan sintetik dan alami (Gulcin, Uguz, Oktay, Beydemir, dan Kufrevioglu, 2004). a. Antioksidan sintetik Antioksidan sintetik merupakan antioksidan yang dibuat melalui sintesis secara kimia, contohnya: ter-butyl hidroquinone (tBHQ), butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), dan propil galat (PG) (Gulcin, et al., 2004). Konsentrasi rendah dari antioksidan tBHQ dan BHA telah lama digunakan untuk mencegah oksidasi dari produk makanan sehingga dapat menstabilkan produk tersebut (nutrisi, rasa, maupun warna). Dalam konsentrasi yang tinggi, tBHQ dapat menyebabkan kanker. Penyebabnya adalah metabolit dari oksidasi tBHQ, yaitu 2-tertbutyl-1,4-benzoquinone (tBBQ) dan Reactive Oxygen Species (ROS) (Gharavi, Haggarty, dan El-Kadi, 2007). b. Antioksidan alami Antioksidan alami merupakan antioksidan yang diproduksi langsung oleh tanaman maupun tubuh, contohnya: senyawa polifenol flavonoid seperti rutin, tanin, katalase dan glutation peroksidase bekerja dengan cara mengubah H2O2 menjadi H2O dan O2, sedangkan superoksid dismutase bekerja dengan cara mengkatalisis reaksi dismutasi dari radikal anion superoksida menjadi H2O2 (Gulcin, et al., 2004).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 11

E. Spektrofotometri UV-Visibel Spektrofotometri visibel merupakan teknik spektroskopik yang memakai sumber radiasi elektromagnetik sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Distribusi elektron didalam suatu senyawa organic secara umum yang dikenal sebagai orbital elektron pi (п), sigma (α) dan elektron tidak berpasangan (n). Apabila pada molekul dikenakan radiasi elektromagnetik maka akan terjadi ekstasi elektron ke tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal sebagai orbital elektro anti bonding (Mulja dan Suharman, 1995; Fessenden dan Fessenden, 1995). Setiap senyawa memiliki energi yang sama dengan perbedaan energi antara keadaan tingkat dasar dan energi keadaan tereksitasi, maka elektron-elektron pada keadaan tingkat dasar akan dieksitasi ke tingkat energi eksitasi dan sebagian energi cahaya yang sesuai dengan panjang gelombang ini diserap. Frekuensi yang diserap setiap senyawa sangat spesifik karena perbedaan energi antara tingkat dasar dan tingkat eksitasi setiap senyawa juga spesifik (Sastrohamidjojo, 2001). Interaksi antara senyawa yang mempunyai gugus kromofor dengan radiasi elektromagnetik

dan spektra absorbansi elektromagnetik.

Spektrum visible

mempunyai absorbansi antara 400-800 nm, sedangkan spektrum UV mempunya i absorbansi antara 100-400 nm (Fessenden dan Fessenden, 1995). Kromofor merupakan gugus tak jenuh kovalen yang dapat menyerap radiasi dalam daerahdaerah UV dan visibel, pada senyawa organik dikenal pula gugus auksokrom, yaitu gugus jenuh yang terikat pada kromofor. Terikatnya gugus auksokrom pada

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 12

kromofor dapat mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum (Sastrohamidjojo, 2001).

F. Metode DPPH Uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH merupakan metode uji yang paling sering digunakan. Metode ini menggunakan senyawa radikal bebas 1,1-dyphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Senyawa DPPH merupakan senyawa radikal nitrogen yang tidak stabil karena adanya elektron bebas yang tidak berpasangan yang dapat menyebabkan DPPH memiliki sifat reaktif. DPPH akan mengalami reduksi melalui proses donasi elektron sehingga warna DPPH akan mengalami perubahan warna dari ungu menjadi kuning (Halliwell dan Gutteridge, 2000). Parameter yang digunakan metode ini adalah parameter IC 50 . IC50 merupakan parameter konsekuensi yang ekuivalen dapat memberikan 50% efek aktivitas antioksidan. Parameter ini dapat diketahui dengan mengintepretas ika n hasil uji dalam suatu data eksperimental (Molyneux, 2004).

G. Landasan Teori Reaksi oksidasi berlebihan yang terjadi di dalam tubuh dapat memic u terbentuknya radikal bebas. Radikal bebas merupakan suatu senyawa yang memiliki elektron tidak berpasangan yang menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif dan tidak stabil. Untuk mencapai kestabilan, elektron tidak berpasangan akan mencari pasangan elektron di sekitarnya. Radikal bebas dapat mengoksidas i

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 13

asam nukleat, protein, lipid, DNA, dan dapat memicu penyakit degeneratif. Senyawa antioksidan dapat meredam radikal bebas dan menghambat reaksi oksidatif, sehingga kerusakan sel akibat radikal bebas dapat dicegah (Winarsi, 2007) Nanas merupakan tanaman yang mudah ditemukan di daerah tropis. Selama bertahun-tahun telah banyak kegunaan dari bagian-bagian buah nanas yang digunakan dalam pemeliharaan kesehatan. Seperti kulit nanas yang telah menjadi bahan penting dalam pengobatan tradisional untuk mengobati berbagai penyakit selama bertahun-tahun. Berbagai penelitian telah membuktikan bahwa kulit nanas mempunyai kemampuan sebagai antioksidan dan aktivitas biologis lainnya (Hossain dan Rahman, 2011; da Silva et al, 2010; Erukainure et al, 2012). Bromelain merupakan salah satu enzim protease yang umum digunakan dalam perawatan luka. Enzim protease yang digunakan dalam perawatan luka untuk regenerasi jaringan dan mencegah timbulnya keloid berpotensi memiliki aktivitas antioksidan (Pendzhiev, 2002). Enzim ini tidak hanya dapat ditemukan di bagian daging, stem dan daun, namun juga di kulit nanas (Hebbar, Sumana, dan Raghvarao, 2008). Kandungan protein total dalam suatu sampel dapat dianalisis secara kualitatif dengan menggunakan metode uji warna ninhidrin dan kuantitatif dengan menggunakan metode spektrofotometri. Prinsip uji warna yaitu pembentukan warna biru-ungu dari reaksi antara ninhidrin dan asam amino (Bottom, Hanna, dan Siehr, 1978). Prinsip spektrofotometri yaitu protein yang memiliki cincin aromatik seperti fenilalanin, triptofan, histidin, dan tirosin memiliki serapan yang kuat pada

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 14

panjang gelombang 280 nm. Intensitas serapan pada panjang gelombang tersebut sebanding dengan jumlah enzim dalam sampel (Ahmed, 2005). Metode DPPH merupakan metode pengujian aktivitas antioksidan yang sederhana dan cepat. Metode ini menggunakan radikal bebas DPPH untuk menguji suatu senyawa antioksidan dalam meredam radikal bebas. Elektron tak berpasangan DPPH memberikan serapan yang kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna ungu. Warna ungu akan berubah menjadi kuning ketika terdapat senyawa antioksidan yang meredam radikal bebas DPPH (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009; Molyneux, 2004).

H. Hipotesis Ekstrak dari kulit buah nanas (Ananas comosus (L.) Merr.) memiliki aktivitas antioksidan.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional Variabel – variabel yang digunakan pada penelitian ini adalah: 1. Variabel utama a. Variabel bebas Variasi konsentrasi ekstrak kulit buah nanas. b. Variabel tergantung Aktivitas antioksidan (%IC) dan kadar enzim bromelain ekstrak kulit buah nanas. 2. Variabel pengacau a. Variabel pengacau terkendali Jumlah (g) kulit yang digunakan, suhu evaporasi, waktu pengendapan, dan lama penyimpanan ekstrak kulit buah nanas. b. Variabel pengacau tidak terkendali Suhu blender, suhu sentrifugasi, tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan, umur buah yang dipanen, cara panen.

15

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 16

3. Definisi Operasional a. Aktivitas antioksidan Aktivitas antoksidan adalah kemampuan ekstrak kulit buah nanas untuk menangkap radikal DPPH dibandingkan dengan kontrol negatif. b. Ekstrak kulit buah nanas Ekstrak kulit buah nanas adalah ekstrak yang berbentuk cairan kental yang diperoleh dari presipitasi crude extract dengan etanol, dimana menurut Soares (2012) crude extract merupakan supernatan hasil dari proses ekstraksi kulit buah nanas. c. Kadar enzim bromelain Kadar enzim bromelain adalah suatu nilai yang dinyatakan dalam bentuk persentase yang menyatakan kadar bromelain dalam ekstrak kulit buah nanas yang ditetapkan menurut Ahmed (2005) yang dihitung terhadap bovine serum albumin (BSA) sebagai reference standard dalam penghitungan kadar enzim bromelain. d. Persen inhibition concetration (%IC) Persen inhibition concetration adalah suatu nilai yang dinyatakan dalam bentuk persentase yang menyatakan kemampuan enzim bromelain dalam ekstrak kulit buah nans dalam menangkap radikal DPPH. e. Inhibition concetration 50 (IC50) Inhibition concetration 50 adalah nilai dosis enzim bromelain dalam ekstrak kulit buah nanas yang dapat menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 17

C. Bahan Penelitian Bahan uji yang digunakan adalah kulit buah nanas yang dibeli pada bulan Februari - April 2016 dan diperoleh dari pedagang buah pasar Stan, Maguwoharjo, kabupaten Sleman, Yogyakarta. Bahan kimia kualitas farmasetis yang digunakan dalam penelitian ini yaitu aquadest; bahan kimia kualitas teknis (CV. General Labora) berupa ethanol dan air deionisasi; bahan kimia kualitas pro analitik (E. Merck) berupa metanol dan ninhidrin; bahan kimia kualitas pro analitik (Sigma Chem. Co.) berupa rutin dan DPPH; bahan kimia kualitas pro analitik (DiaSys) berupa bovine serum albumine (BSA).

D. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain: blender (Maspion), corong Buchner (Desaga), mikropipet 50-200 µL (Acura 825, Socorex), vortex (Stuart Scientific), sentrifuge (Hettich), magnetic stirrer (Thermo Scientific), vacuum rotary evaporator (BUCHI Rotavator R-3), waterbath (Memmert), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV mini-1240 UV-Vis Spektrofotometer), neraca analitik (Metler Tolledo, BP 160P), serta alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium (Pyrex-Germany).

E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi buah nanas. Determinasi buah nanas dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta berdasarkan Backer dan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 18

van Den Brink (1963) dengan mencocokan karakteristik buah nanas yang digunakan dengan gambar, taksonomi, dan keterangan kelompok tumbuhan. Hal ini dilakukan untuk mengetahui kebenaran identitas tanaman yang digunakan dalam penelititan serta untuk meminimalisir adanya kesalahan yang terjadi ketika pengambilan sampel. 2. Pengumpulan kulit buah nanas. Kulit buah nanas diperoleh dari pasar Stan, Maguwoharjo, kabupaten Sleman, Yogyakarta. kulit yang diambil berasal dari buah yang memiliki jenis dan tingkat kematangan yang sama. 3. Pembuatan ekstrak kulit buah nanas. Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Soares, Vaz, Correia, Pessoa, dan Carneiro-da-Cunha (2012) dengan beberapa modifikasi. a. Preparasi buah nanas (Ananas comosus (L.) Merr). Buah Nanas dicuci dengan air mengalir, dikeringkan, dan dikupas. Kulit buah sebanyak 70,0 g dipotong kecil-kecil kemudian dicampur dengan air deionisasi 4°C (1:1 w/w) dan dihaluskan menggunakan blender. Larutan jus disaring dengan menggunakan kain katun tipis lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan kemudian dikumpulkan dalam gelas beker untuk proses selanjutnya. b. Purifikasi dengan teknik ethanol precipitation Supernatan dari kulit buah nanas sebanyak 100,0 mL didinginkan hingga mencapai suhu 4°C kemudian ditambahkan dengan etanol 90% dengan perbandingan 1:3. Campuran diaduk menggunakan magnetic stirrer selama 5

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 19

menit dan didiamkan selama 24 jam pada suhu 4°C sehingga didapatkan endapan koloidal putih hingga kuning muda. Setelah terjadi pengendapan, campuran kemudian diuapkan untuk memisahkan etanol menggunakan vacuum rotary evaporator dengan suhu 50°C selama 30 menit. Endapan dikumpulkan dalam cawan petri dan dipekatkan menggunakan waterbath dengan suhu 50°C selama 3 jam. Cairan kental berwarna kekuningan dikumpulkan sebagai ekstrak kulit buah nanas. 4. Analisis kualitatif Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Panda (2000) dengan beberapa modifikasi. BSA sebanyak 0,5 mL dengan konsentrasi 50 mg/mL dilarutkan ke dalam 10,0 mL air deionisasi, ekstrak kulit buah nanas sebanyak 250,0 mg dilarutkan ke dalam 50,0 mL air deionisasi, dan ninhidrin sebanyak 350,0 mg dilarutkan ke dalam 100,0 mL etanol 90%. Larutan BSA diambil sebanyak 1 mL lalu dimasukan ke dalam tabung reaksi dan ditambah dengan larutan ninhidrin sebanyak 5 mL. Campuran dipanaskan pada suhu 100°C selama 15 menit sehingga muncul warna biru-ungu yang menandakan terjadi reaksi antara asam amino dengan ninhidrin. Analisis yang sama juga dilakukan untuk larutan ekstrak kulit buah nanas dan air deionisasi. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. 5. Penetapan kadar enzim bromelain ekstrak kulit buah nanas Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Ahmed (2005) dengan beberapa modifikasi.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 20

a. Pembuatan larutan uji Ekstrak kulit buah nanas ditimbang sebanyak 250,0 mg dan dilarutkan ke dalam 25,0 mL aquadest (5°C) sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 10000 µg/mL. b. Pembuatan larutan pembanding BSA BSA sebanyak 0,5 mL dengan konsentrasi 50 mg/mL dilarutkan ke dalam 25,0 mL aquadest (5°C). Larutan tersebut diambil sebanyak 4,0; 5,5; 7,0; 8,5 dan 10,0 mL lalu ditambah dengan aquadest (5°C) hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan pembanding BSA sebesar 400, 550, 700, 850 dan 1000 µg/mL. c. Penetapan panjang gelombang maksimum Larutan baku BSA dengan konsentrasi 400, 700, dan 1000 µg/mL dimasukan ke dalam tabung reaksi dan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT. Larutan diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm. d. Pengukuran absorbansi larutan standar dan uji Larutan BSA dengan konsentrasi 400, 550, 700, 850 dan 1000 µg/mL diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum terhadap blanko yang terdiri dari aquadest (5°C). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. Kemudian, larutan uji dengan konsentrasi 10000 µg/mL diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum terhadap blanko yang terdiri dari aquadest (5°C). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 21

e. Estimasi kadar enzim bromelain Berdasarkan hasil dari prosedur 5 d untuk BSA dan ekstrak kulit buah nanas kemudian dihitung nilai % kadar enzim. 6. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Thangaraj (2016) dengan beberapa modifikasi. a. Pembuatan larutan DPPH DPPH sebanyak 15,8 mg ditimbang dan dilarutkan ke dalam metanol p.a. hingga 100,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan DPPH sebesar 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru. b. Pembuatan larutan standar rutin Rutin sebanyak 5,0 mg dilarutkan ke dalam metanol p.a hingga 100,0 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak 2,0; 3,0; 4,0; 5.0 dan 6,0 mL lalu ditambah dengan metanol p.a hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar rutin sebesar 10, 15, 20, 25, dan 30 µg/mL. c. Pembuatan larutan uji Ekstrak kulit buah nanas sebanyak 250,0 mg ditimbang dan dilarutkan ke dalam aquadest hingga 25,0 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 dan 5,0 mL lalu ditambah dengan aquadest (5°C) hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 dan 5,0 mg/mL.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 22

7. Uji Aktivitas Antioksidan Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Thangaraj (2016) dengan beberapa modifikasi. a. Uji Pendahuluan Dalam tiga buah tabung reaksi, masing-masing ditambah dengan larutan DPPH dan air deionisasi, larutan rutin 25 µg/mL, dan larutan bromelain 5 mg/mL sebanyak 1,0 mL kemudian ditambah dengan metanol p.a sebanyak 3 mL. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan didiamkan selama 30 menit. Setelah 30 menit, perubahan warna dari ketiga larutan diamati. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. b. Penentuan operating time (OT) Dalam tiga buah labu ukur 5 mL, masing-masing ditambah dengan larutan DPPH dan larutan rutin 5, 15, dan 25 µg/mL sebanyak 1,0 mL kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometes visibel pada panjang gelombang 517 nm tiap 5 menit selama 1 jam. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. c. Penetapan panjang gelombang maksimum Dalam tiga buah labu ukur 10 mL, masing-masing ditambah dengan larutan DPPH sebanyak 0,5; 1,0; dan 1,5 mL, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi DPPH sebesar 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan dimasukan ke dalam tabung reaksi dan divortex selama

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 23

30 detik, lalu didiamkan selama OT. Larutan diukur serapannya pada panjang gelombang 400-600 nm. d. Pengukuran absorbansi larutan kontrol DPPH Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Setelah OT, larutan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. e. Pengukuran absorbansi larutan uji Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan 2 mL larutan pembanding dan larutan uji pada berbagai seri konsentrasi yang telah dibuat, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT. Setelah OT, larutan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. f. Estimasi aktivitas antioksidan Berdasarkan hasil dari prosedur 7 d dan e untuk rutin dan ekstrak bromelain kemudian dihitung niai %IC dan IC50.

F. Analisis Hasil Kadar protein total dalam ekstrak kulit buah nanas dinyatakan sebagai persentase. Nilai absorbansi larutan uji dimasukan ke dalam persamaan regresi linier kurva baku BSA dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan baku, sedangkan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 24

sumbu y adalah absorbansi sehingga diperoleh konsentrasi protein total yang kemudian dikonversi menjadi persentase kadar protein total dalam ekstrak kulit buah nanas. Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%IC) dihitung berdasarkan rumus: Absorbansi larutan kontrol − Absorbansi larutan pembanding/uji ×100 % Absorbansi larutan kontrol

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun pembanding, sedangkan sumbu y adalah %IC. Data lalu dianalisis secara statistik untuk menentukan ada atau tidaknya perbedaan bermakna antara nilai IC50 larutan pembanding dan larutan uji. Analisis statistik dilakukan dengan panduan Bolton dan Bon (2010) dan dengan software R 3.2.5. Nilai IC50 diuji dengan Shapiro-Wilk untuk mengetahui distribusi data tiap kelompok. Apabila didapat distribusi data yang normal maka analisis dilanjutkan dengan uji F dengan taraf kepercayaan 95% untuk mengetahui homogenitas data kelompok. Apabila didapat data yang homogen maka analisis dilanjutkan dengan uji T-Independent untuk melihat perbedaan antar kelompok bermakna (signifikan) (p<0,05) atau tidak bermakna (tidak signifikan) (p>0,05). Apabila didapat data yang tidak homogen maka analisis dilanjutkan dengan uji T-Independent unequal variances (Welch’s T-test) untuk melihat kebermaknaan perbedaan tiap kelompok. Apabila didapatkan distribusi tidak normal, maka analisis dilanjutkan dengan uji Lavene dengan taraf kepercayaan 95% untuk mengetahui homogenitas data kelompok. Analisis dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney untuk melihat perbedaan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 25

antar kelompok bermakna (signifikan) (p<0,05) atau tidak bermakna (tidak signifikan) (p>0,05).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Buah Determinasi merupakan sebuah tahap awal dalam sebuah penelitian dengan menggunakan

tanaman.

Determinasi

tanaman

bertujuan

untuk

mengetahui

kebenaran identitas tanaman yang digunakan dalam penelitian serta untuk meminimalisir akan adanya kesalahan yang terjadi ketika melakukan pengambila n sampel. Jaminan kebenaran sampel sangat penting karena pada buah nanas terdiri dari berbagai macam varietas. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, pada tanggal dengan acuan buku Flora of Java (Backer dan van Den Brink, 1963).

B. Hasil Pengumpulan Bahan Bahan yang diperlukan adalah kulit buah nanas. Bahan tanaman pada penelitian ini diperoleh dari Pasar Stan, Maguwoharjo, Yogyakarta. Buah nanas yang digunakan adalah buah nanas yang masih muda dan dibeli dari satu orang penjual saja pada hari yang sama. Pertimbangan tersebut dikarenakan dengan umur buah nanas yang masih muda diharapkan kandungan bromelain yang masih tinggi dan untuk diharapkan buah nanas yang diperoleh berasal dari tempat tumbuh yang sama, serta varietas yang sama.

26

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 27

C. Hasil Preparasi Sampel Kulit buah nanas yang telah dikupas dari daging buah kemudian diblender untuk mendapatkan ukuran partikel yang lebih kecil. Ukuran partikel yang lebih kecil akan membuat luas permukaan sampel yang mengalami kontak dengan pelarut semakin

besar. Kontak dengan pelarut yang semakin besar akan

memudahkan pelarut untuk menarik senyawa yang diinginkan. Adanya kontak antar penyari dengan sampel mengakibatkan adanya kesempatan penyari untuk masuk menembus membran sel dan menarik senyawa yang diinginkan (Rahayu, 2009). Air deionisasi digunakan sebagai pelarut karena dapat melarutkan enzim bromelain yang bersifat hipofilik yang terkandung di dalam kulit buah nanas. Kulit buah yang telah diblender kemudian disaring menggunakan corong Buchner yang dilapisi dengan kain katun dengan bantuan pompa vakum. Hasil penyaringan yang telah didapat kemudian didinginkan sampai pada suhu 4o C. Hal ini berguna untuk menjaga supaya enzim tidak rusak dan tetap stabil serta menjaga keberadaan aktivitas dari enzim bromelain. Selain itu, menurut Dennison (2003), menjaga proses ekstraksi dalam keadaan dingin dapat menjaga enzim dari denaturasi dan degradasi. Hal ini disebabkan enzim secara struktur sangat labil dan sangat rentan terhadap degradasi mikroba. Denaturasi dan degradasi dapat diminimalisir dengan menjaga enzim dalam keadaan dingin pada suhu 4o C. Filtrat kemudian disentrifugasi supaya enzim kasar terpisah dari sisa-sisa jaringan nanas. Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Hasil sentrifugasi yang didapat berupa endapan yang merupakan sisa-sisa jaringan nanas dan supernatan yang mengandung enzim kasar bromelain. Supernatan yang

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 28

mengandung bromelain diambil sebagai crude extract. Crude extract umumnya mempunyai aktivitas yang rendah karena masih merupakan campuran dari beberapa enzim dan ada kemungkinan masih terkandung senyawa-senyawa yang lain selain enzim. Purifikasi dilanjutkan dengan pendinginan ekstrak kasar pada suhu 4°C, kemudian dilakukan penambahan etanol dingin (90%) dengan perbandingan 1:3. Campuran kemudian

diaduk dengan menggunakan

magnetic stirrer untuk

membantu etanol menarik senyawa-senyawa selain bromelain untuk terpisah. Etanol merupakan pelarut organik yang sesuai untuk memisahkan senyawa selain bromelain karena menurut Englard dan Seifter (1990), pelarut organik seperti etanol akan mengakibatkan

pengendapan

terhadap

protein.

Campuran

kemudian

didiamkan selama 24 jam dalam lemari pendingin. Hal ini untuk memberi waktu bagi campuran untuk terpisah membentuk endapan koloidal, dimana bromelain tidak larut dalam pelarut organik. Endapan koloidal yang telah terbentuk kemudian dipisahkan dari campuran hingga hanya tersisa endapan koloidal dengan etanol yang masih tersisa sedikit di dalam campuran. Campuran kemudian dihilangkan sisa etanolnya dengan rotary evaporator. Proses dalam rotary evaporator ini dilakukan pada suhu 50o C untuk menjaga kandungan enzim bromelain yang ada didalam ekstrak kulit buah nanas tetap stabil. Prinsip kerja dari rotary evaporator ini adalah memisahkan campuran dari pelarutnya dengan adanya penurunan tekanan, sehingga pelarut akan lebih cepat menguap di bawah titik didihnya dan senyawa yang dituju dari pemisahan pelarut ini tidak mengalami kerusakan. Langkah selanjutnya dilakukan pemekatan di atas waterbath. Pemekatan ini dilakukan untuk menghilangkan sisa etanol dalam

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 29

ekstrak kulit buah nanas hingga didapatkan bobot tetap dari ekstrak. Ekstrak kental yang telah didapat kemudian ditimbang bobot tetapnya. Bobot tetap menurut Faarmakope Indonesia (1979) adalah bobot yang telah mengalami penimbanga n dua kali berturut-turut tidak mengalami perubahan lebih dari 0,5 mg tiap gram sisa yang ditimbang. Bobot ekstrak kulit buah nanas yang didapat sebesar 3,299 gram dengan rendemen yang didapat sebesar 1,5713%. Pada penelitian ini tidak dilakukan fraksinasi karena belum diketahui secara pasti kandungan senyawa yang ada pada ekstrak kulit buah nanas yang dibuat, sehingga hanya digunakan ekstrak kulit buah nanas.

D. Hasil uji pendahuluan 1. Uji Ninhidrin Uji ninhidrin merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui adanya keberadaan protein yang diharapkan pada kulit buah nanas. Uji ini merupakan uji kualitatif yang menjadi dasar untuk uji kuantitaf penetapan kadar enzim bromelain. Uji dengan metode ninhidrin ini menghasilkan warna ungu (Ruherman’s Purple) jika dalam reaksi yang diujikan terdapat asam amino (Boyer, 2011).

Uji ini

merupakan uji yang cepat dan sensitive dalam mendeteksi asam amino, protein, dan peptide. Akan tetapi uji ini tidak mampu memberikan hasil yang selektif sehingga tidak bisa digunakan untuk menentukan asam amino dalam tingkat yang lebih spesifik.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 30

Gambar 1. Reaksi Ninhidrin dengan protein (Bottom, Hanna dan Siehr, 1978) Ninhidrin akan bereaksi dengan gugus amino alfa yang terdapat dalam asam amino, peptida dan protein. Karena terjadi reaksi antara ninhydrin dengan gugus amino

alfa maka akan terbentuk

hidrindantin.

Ninhidrin

kemudian

akan

berinteraksi dengan hidrindantin dan NH3 untuk membentuk senyawa yang mampu menghasilkan warna ungu.

Gambar 2. Hasil uji ninhidrin

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 31

Uji pendahuluan ini menggunakan kontrol negatif. Kontrol negatif yang digunakan yaitu larutan ninhidrin yang dicampur dengan air deionisasi untuk menunjukkan jika hasilnya negatif. Uji pendahuluan ini memberikan hasil positif dilihat dari terbentuknya warna biru-keunguan pada campuran larutan ninhidr in dengan larutan sampel. Sehingga dapat disimpulkan bahwa kulit buah nanas mengandung protein, yang salah satunya adalah bromelain. 2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan Uji pendahuluan aktivitas antioksidan bertujuan untuk mengetahui adanya keberadaan senyawa protein yang berperan sebagai senyawa antioksidan. Uji ini merupakan uji kualitatif yang digunakan sebagai dasar untuk uji kuantitatif aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah nanas. Prinsip uji ini adalah reaksi antara ekstrak kulit buah nanas dengan 1,1-difenil-2-pikrihidrazil (DPPH). Menurut Molyneux (2004), DPPH merupakan senyawa radikal bebas yang stabil karena adanya resonansi elektron di keseluruhan molekul yang menunjukka n bahwa molekul stabil. Resonansi ini ditunjukkan dengan warna DPPH yang berwarna ungu. Senyawa antioksidan yang terkandung di dalam ekstrak akan merubah warna DPPH dari ungu menjadi kuning. Hal tersebut dikarenakan senyawa antioksidan memiliki elektron bebas yang tidak berpasangan sehing ga dapat mengikat elektron bebas dari DPPH (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 32

A B C

Gambar 3. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A : kontrol negatif = DPPH + metanol; B : kontrol positif = DPPH + rutin; C : sampel)

Uji ini menggunakan kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positif yang digunakan adalah DPPH yang direaksikan dengan rutin yang menunjukka n hasil positif. Kontrol negatif yang digunakan adalah DPPH yang menunjukkan hasil negatif. Reaksi antara ekstrak kulit buah nanas dengan DPPH menunjukkan hasil positif dengan adanya perubahan warna ungu menjadi kuning yang dapat dilihat secara visual dengan mata. Sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak kulit buah nanas memiliki aktivitas sebagai antioksidan.

E. Hasil Penetapan Kadar Enzim Bromelain Terhadap BSA Dalam tanaman nanas terkandung banyak mineral, vitamin, lemak, glukosa dan protein. Senyawa-senyawa tersebut banyak tersebar di berbagai bagian, antara lain daging buah, daun, kulit, tangkai, dan batang. Enzim bromelain merupakan salah satu unit fungsional dari protein itu sendiri, dimana dari berbagai penelitia n terdahulu diketahui bahwa kulit nanas mengandung enzim bromelain. Maka dari itu, dilakukan penetapan kadar enzim bromelain yang terkandung dalam ekstrak kulit buah nanas (Ketnawa, Rawdkuen, dan Chaiwut, 2010).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 33

0.8 y = 0,0006833x - 0,000533 R = 0,9999

0.7

Absorbansi

0.6 0.5 0.4 0.3

0.2 0.1 0 0

200

400

600

800

1000

1200

Konsentrasi (µg/mL)

Gambar 4. Kurva baku Bovine Serum Albumin (BSA) Penetapan kadar dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometr i pada daerah UV pada panjang gelombang 280 nm. Menurut Ahmed (2005), pengukuran kadar pada panjang gelombang 280 nm ini dapat diaplikasikan pada protein murni, dimana asam amino yang dapat dideteksi merupakan asam amino yang mempunyai cincin aromatic seperti tryptophan, tyrosin, phenylamin, dan histidin. Kelebihan metode ini adalah mudah, cepat dan tidak merusak kandungan protein yang ada dalam sampel. Namun metode ini mempunyai kekurangan yaitu cakupan protein yang dideteksi cukup variatif sehingga tidak mampu menguk ur kadar protein yang lebih spesifik. Selain itu juga sensitivitas dari metode ini mencapai 0,2 – 2 mg/ml dan sangat tergantung dari keberadaan jumlah gugus aromatik yang ada pada asam amino. Bovine Serum Albumin (BSA) digunakan sebagai standar referens karena sifatnya yang stabil dan telah banyak digunakan dalam penelitian sebelumnya terhadap penghitungan kadar protein.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 34

Tabel I. Hasil pengukuran absorbansi kadar enzim bromelain terhadap BSA

Replikasi

1

2

3

Konsentrasi (µg/mL)

Absorbansi

400 550 700 850 1000 400 550 700 850 1000 400 550 700 850 1000

0,273 0,375 0,478 0,580 0,683 0,251 0,358 0,455 0,561 0,662 0,274 0,371 0,477 0,585 0,684

Persamaan regresi linear y = 0,0006833x – 0,000533 r = 0,9999

y = 0,0006833x – 0,020933 r = 0,9999

y = 0,0006893x – 0,004333 r = 0,9998

Hasil pengukuran absorbansi pada replikasi 1 dan 2 menunjukkan nilai r sebesar 0,9999. Sedangkan pada replikasi 3 menunjukkan nilai r sebesar 0,9998. Nilai r yang baik menunjukkan koefisisen korelasi yang baik juga, ditunjukkan dari semakin mendekatinya titik-titik hasil perbandingan antara konsentrasi BSA dengan absorbansi BSA terhadap garis lurus yang terbentuk (Gambar 6). Secara berturut-turut, persamaan regresi yang didapat dari replikasi 1, 2, dan 3 yaitu: y = = 0,0006833x – 0,000533; y = 0,0006833x – 0,020933; dan y = 0,0006893x – 0,004333. Hasil yang diperlihatkan pada tabel I menunjukkan bahwa terdapat hubungan yang linear antara konsentrasi BSA dengan absorbansi yang dihasilkan. Hal ini sesuai dengan Ahmed (2005) yang menyatakan bahwa semakin

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 35

tinggi konsentrasi dari protein yang diukur (dalam hal ini adalah BSA) maka semakin tinggi pula absorbansi yang dihasilkan. Persamaan regresi yang didapat kemudian akan digunakan dalam menentukan nilai kadar enzim bromelain. Ekstrak kulit buah nanas diukur nilai absorbansinya untuk kemudian digunakan dalam menghitung kadar enzim bromelain yang dihitung terhadap BSA. Secara berturutturut nilai absorbansi ekstrak kulit buah nanas yang didapat adalah 0,545; 0,531; dan 0,531. Tabel II. Hasil penetapan kadar enzim bromelain

Replikasi 1 2 3

Bobot enzim (mg)

Bobot ekstrak (mg)

19,96 19,44 19,44

250,5 250,5 250,5

Kadar Enzim (%) b/b 7,95 7,76 7,76

x ± SD

7.8233 ± 0,1096

Hasil penetapan kadar enzim bromelain dari kulit buah nanas yang dihitung terhadap BSA dapat dilihat pada tabel 2. Secara rata-rata, kadar enzim yang didapat dari penelitian ini sebesar 7,8233 % b/b. Hasil ini sangat berbeda jauh dengan hasil yang didapatkan oleh penelitian yang dilakukan Bresolin et al (2013) yang mampu mencapai 75%. Hal yang mampu menyebabkan perbedaan hasil yang sangat jauh ini salah satunya adalah singkatnya waktu sentrifugasi dimana pada penelitia n Bresolin et al (2013) waktu sentrifugasi mencapai 30 menit dan pada penelitian ini waktu sentrifugasi hanya mencapai 10 menit. Kemudian bentuk ekstrak kental sebagai hasil purifikasi dari ekstrak kulit buah nanas yang memungkinkan masih adanya kandungan protein yang lain selain bromelain dan juga masih adanya

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 36

kandungan air yang terdapat di dalam ekstrak kental. Hal ini berbeda dengan hasil dari Bresolin et al (2013) dimana hasil purifikasi mencapai bentuk serbuk.

F. Hasil Optimasi Uji Aktivitas Antioksidan 1. Penentuan Operating Time (OT) Penentuan OT bertujuan untuk mendapatkan rentang waktu yang tepat dalam pengukuran absorbansi sampel, dimana reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa uji telah berlangsung secara optimal sehingga dapat menghasilka n absorbansi yang stabil. Penentuan OT ini dilakukan dengan cara menguk ur absorbansi dari larutan DPPH dengan larutan rutin menggunakan spektrofotometer visible pada panjang gelombang serapan maksimum teoritis, yaitu 517 nm (Kedare dan Singh, 2011). Penentuan OT didasarkan pada waktu ketika nilai absorbansi mulai stabil atau selisih nilai absorbansi tiap selang waktu mulai kecil. Pengukuran absorbansi untuk penentuan OT ini dilakukan tiap selang waktu 5 menit selama 60 menit. Dalam penentuan OT ini digunakan larutan rutin dengan 3 konsentrasi yang berbeda, yaitu 5 µg/mL, 15 µg/mL, dan 25 µg/mL. Setiap konsentrasi akan memberikan nilai absorbansi yang berbeda pada panjang gelombang yang maksimum, sehingga ketiga konsentrasi tersebut akan merepresentasikan OT pada setiap konsentrasinya.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Absorbansi

37

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Waktu (Menit)

5 µg/ml

15 µg/ml

25 µg/ml

Gambar 5. Kurva penentuan OT rutin Hasil yang didapat menunjukkan bahwa nilai absorbansi yang stabil pada larutan rutin ditunjukkan mulai pada menit 30 sampai 60. Hal ini sesuai dengan teori dari Blois (1958) dan penelitian dari Kim et al (2002). Secara teoritis hal ini menunjukkan bahwa pada menit ke-30 seluruh senyawa yang memliki daya antioksidan pada larutan pembanding dan larutan uji telah tepat bereaksi dengan radikal DPPH, sehingga OT untuk reaksi radikal DPPH dengan larutan pembanding dan uij adalah 30 menit. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa pengukuran akan memberikan hasil yang reprodusibel bila diukur pada menit ke-30 sampai 60. 2. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum (λ maks) Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk mendapatkan panjang gelombang yang akan digunakan untuk mengukur nilai serapan pada sampel. Pada panjang gelombang maksimum inilah DPPH akan memberika n serapan yang

maksimum.

Penentuan

panjang

gelombang

maksimum

ini

menggunakan 3 konsentrasi larutan DPPH, yaitu 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Setiap konsentrasi akan memberikan nilai serapan yang berbeda pada panjang

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 38

gelombang maksimum. Nilai serapan yang berbeda pada panjang gelombang maksimum ini merepresentasikan penggunaan ketiga konsentrasi yang berbeda dalam penenentuan panjang gelombang maksimum. Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada rentang panjang gelombang 400-600 nm. Tabel III. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum DPPH Konsentrasi λ maksimum λ maksimum λ maksimum larutan DPPH hasil scanning yang teoritis digunakan 0,020 mM 515,5 517,0 0,040 mM 515,0 515,0 0,060 mM 515,5 Dari tabel dapat dilihat bahwa panjang gelombang maksimum yang didapat adalah 515 nm, yang merupakan rata-rata dari ketiga panjang gelombang dari 3 konsentrasi yang berbeda. Hasil yang didapatkan berbeda 2 nm dengan panjang gelombang maksimum teoritis, yaitu 517 nm. Perbedaan selisih antara panjang gelombang maksimum uji dengan panjang gelombang maksimum teoritis ini masih diperbolehkan menurut Farmakope Indonesia IV (1995), dimana pergeseran panjang gelombang yang diperbolehkan yaitu 2 nm dari batas yang ditentukan.

G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Uji aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah nanas dilakukan dengan menggunakan metode DPPH. Prinsip pengukuran aktivitas antioksidan pada metode ini adalah penangkapan elektron bebas dari senyawa radikal yang menyebabkan berkurangnya intensitas warna radikal DPPH dari ungu menjadi kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009). DPPH merupakan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 39

suatu senyawa radikal nitrogen yang tidak stabil karena mempunyai elektron bebas yang tidak berpasangan yang mengakibatkan DPPH mempunyai sifat reaktif. DPPH yang direaksikan dengan senyawa

Gambar 6. Reaksi antara senyawa antioksidan dengan DPPH (Li, Xu, dan Chen, 2014). antioksidan, dalam penelitian ini adalah ekstrak kulit buah nanas, akan mengikat atom H dari senyawa antioksidan sehingga menyebabkan terjadinya delokalisas i elektron. Hal inilah yang menyebabkan DPPH menjadi stabil karena adanya donor elektron dari senyawa antioksidan. Peristiwa tersebut yang menyebabkan sifat DPPH sebagai radikal bebas menurun. Dalam penelititan ini kontrol positif yang digunakan adalah rutin. Rutin merupakan senyawa golongan flavonoid yang telah diketahui mempunyai aktivitas antioksidan. Gugus -OH fenolat dari rutin yang menyebabkan senyawa tersebut mampu mereduksi DPPH dengan menurunkan intensitas warnanya dari ungu menjadi kuning (Li, Xu, dan Chen, 2014). Elektron bebas DPPH akan mengikat satu atom H dari senyawa antioksidan, baik dari rutin maupun senyawa dalam sampel, sehingga mencegah terjadinya resonansi elektron pada DPPH. Hal inila h yang menyebabkan perubahan warna ungu menjadi kuning pada DPPH. Perubahan warna tersebut sebanding dengan jumLah radikal bebas DPPH yang berhasil ditangkap oleh senyawa antioksidan.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 40

60 y = 2.0646x - 9.7888 r = 0.9999

50

%IC

40 30

20 10 0 0

10

20

30

40

Konsentrasi (µg/mL)

Gambar 7. Kurva persamaan regresi linear rutin Pengukuran aktivitas antioksidan pada metode DPPH ini menggunaka n parameter IC50 . IC50 merupakan konsentrasi senyawa uji yang diperlukan untuk menghambat senyawa radikal bebas sebesar 50%. Menurut Zou, Lu, dan Wei (2004), nilai IC50 ini didapatkan dari persamaan regresi linier yang menyatakan adanya hubungan konsentrasi senyawa uji dengan persen aktivitas antioksidan yang ditimbulkan. Hubungan antara aktivitas antioksidan dengan IC50 mempunya i korelasi berbanding terbalik. Semakin kecil nilai senyawa uji IC50, semakin besar aktivitas antioksidan dari senyawa tersebut. Dari tabel IV dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi rutin, semakin kecil nilai absorbansi yang dihasilkan. Hal ini sebanding dengan besarnya persen aktivitas antioksidan yang ditimbulkan, karena semakin banyaknya pendonor atom untuk radikal DPPH yang membuat DPPH menjadi lebih stabil.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 41

Tabel IV. Hasil aktivitas antioksidan rutin dengan menggunakan metode DPPH Replikasi

1

2

3

Konsentrasi (µg/mL)

10 15 20 25 30 10 15 20 25 30 9,8 14,7 19,6 24,5 29,4

Absorban si kontrol DPPH

0,805

0,810

0,798

Absorbansi larutan pembanding

%IC

0,716 0,635 0,554 0,468 0,384 0,710 0,631 0,538 0,450 0,368 0,705 0,630 0,541 0,451 0,365

11,0559 21,1180 31,1801 41,8633 52,2981 12,4221 22,2360 33,7888 44,4444 54,5679 11,6541 21,0526 32,2055 43,4837 54,2606

Persamaan regresi linear

y= 2,0646x – 9,7888 r = 0,9999 y = 2,13x – 9,1082 r = 0,9997 y= 2,1529x – 10,5263 r = 0,9995

Dari gambar dapat dilihat bahwa replikasi 1 dari rutin memiliki persamaan regresi linear dengan nilai r paling baik, yaitu 0,9999. Semakin baik nilai r yang mendekati 1 menunjukkan bahwa semakin baik pula koefisien korelasi dari regresi linear yang ditunjukkan dengan semakin mendekatnya titik-titik hasil perbandinga n antara konsentrasi rutin dengan %IC rutin terhadap garis-garis yang terbentuk. Dengan kata lain, hasil yang ditunjukkan dari gambar menunjukkan bahwa terdapat korelasi antara nilai konsentrasi rutin dengan %IC rutin yang tidak lain adalah aktivitas

antioksidan

yang dihasilkan.

Persamaan regresi yang didapatkan

kemudian digunakan untuk menghitung IC50 .

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 42

Tabel V. Hasil aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah nanas dengan menggunakan metode DPPH Konsentrasi Replikasi (mg/mL)

3,006 3,507 4,008 4,509 5,010 3,0 3,5 4,0 4,5

1

2

5,0 3,0 3,5 4,0 4,5

3

Absorb ansi kontrol DPPH

0,868

0,861

0,874

5,0

Absorbansi larutan pembanding

%IC

0,595 0,552 0,501 0,465 0,415 0,601 0,557 0,513 0,469

31,4516 36,4055 41,0138 46,4287 52,1889 29,9539 35,3077 40,4181 45,5284

0,422 0,609 0,560 0,518 0,468

50,9872 30,3203 35,9267 40,7322 46,4530

0,425

51,3729

Persamaan regresi linear

y= 10,2790x + 0,2994 r = 0,9990 y= 10,4574x 1,3907 r = 0,9999 y= 10,5263x 1,1441 r = 0,9996

60

y = 10.458x - 1.3924 r = 0.9999

50

%IC

40 30 20 10 0 0

1

2

3

4

5

6

Konsentrasi (mg/mL)

Gambar 8. Kurva persamaan linear ekstrak kulit buah nanas

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 43

Persamaan regresi linear dan perhitungan IC50 ekstrak kulit buah nanas ditunjukkan pada tabel V. Dari tabel dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak kulit buah nanas yang digunakan

semakin tinggi persen aktivitas

antioksidannya. Konsentrasi yang digunakan pada ekstrak kulit buah nanas lebih tinggi daripada konsentrasi rutin. Hal ini untuk mendapatkan rentang nilai absorbansi yang masuk dalam rentang 0,2-0,8. Persamaan

regresi linear

yang

telah didapatkan

digunakan

untuk

menghitung nilai IC50 dari masing- masing replikasi. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak kulit buah nanas ditunjukkan pada tabel VI. Tabel VI. Hasil perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak kulit buah nanas Rutin Replikasi 1 2 3

Rerata ± SD IC50 (μg/mL) 28,9591 28,2744 ± 0,6202 27,7503 28,1138 Ekstrak kulit buah nanas

Replikasi 1 2 3

IC50 (μg/mL) 4835,1 4914,2 4858,6

Rerata ± SD 4869,3 ± 28,2744

Secara berturut-turut, nilai IC 50 yang didapat dari ketiga replikasi adalah 4893,4 μg/mL, 4914,2 μg/mL, dan 4858,6 μg/mL, dengan rerata (4888,733 ± 28,744) μg/mL. Hal ini jika dibandingkan dengan penelitian dari Hatam, Suryanto dan Abidjulu (2013), hasil yang didapatkan jauh berbeda dimana nilai IC 50 yang didapatkan oleh penelitian Hatam, Suryanto dan Abidjulu mencapai 1513,56

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 44

μg/mL. Hal yang menyebabkan perolehan nilai IC 50 pada penelitian ini sangat tinggi masih belum dipahami oleh peneliti. Uji statistik dilakukan setelah mendapatkan nilai IC 50. Uji statistik ini digunakan untuk memastikan kebermaknaan nilai IC 50 rutin dengan nilai IC50 ekstrak kulit buah nanas. Uji statistik menggunakan software R seri i386 3.0.2. Uji pertama adalah uji normalitas data. Uji ini dilakukan untuk melihat apakah data terdistribusi normal atau tidak. Uji normalitas ini juga yang akan menentukan jenis uji yang akan digunakan selanjutnya. Apabila jumLah data kurang dari 50, maka digunakan uji normalitas Saphiro-Wilk (Dahlan, 2012). Hasil uji statistik menunjukkan nilai p-value untuk IC50 rutin adalah 0,568 dan nilai p-value untuk IC 50 ekstrak kulit buah nanas adalah 0,5605. Kedua data IC50 mempunyai nilai p-value lebih besar dari 0,05 (taraf kepercayaan 95%). Hal ini menunjukkan nilai signifikansi yang dihasilkan lebih besar daripada nilai signifikansi yang ditentukan. Sehingga dapat disimpulkan bahwa nilai IC50 rutin dan ekstrak kulit buah nanas terdistribusi normal. Uji parametrik merupakan uji yang dilakukan setelah uji Saphiro- Wilk dilakukan. Hal ini dilakukan karena data terdisribusi normal. Uji yang dilakukan adalah uji t tidak berpasangan yang digunakan untuk menguji perbedaan dari kedua kelompok data dengan objek yang berbeda, yaitu rutin dan ekstrak kulit buah nanas, dilihat

dari adanya perbedaan rata-rata. Hasil perhitungan

yang didapat

menunjukkan nilai p-value adalah 3,306e-09 . Nilai signifikansi yang didapat lebih besar dari nilai signifikansi yang telah ditentukan, yaitu 0,05 (taraf kepercayaan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 45

95%). Sehingga dapat disimpulkan bahwa nilai rata-rata IC50 rutin dan ekstrak kulit buah nanas tidak berbeda bermakna.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1. Ekstrak kulit buah nanas mempunyai aktivitas antioksidan dengan nilai IC 50 sebesar (4869,3 ± 28,2744) μg/mL. 2. Kadar enzim bromelain dalam ekstrak kulit buah nanas yang dihitung terhadap BSA sebesar (7,8233 ± 0,1096) % b/b.

B. Saran 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai penetapan kadar enzim bromelain dari kulit buah nanas dengan menggunakan standar bromelain. 2. Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut tentang kandungan yang lebih spesifik dari ekstra kulit buah nanas.

46

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR PUSTAKA Ames, B.N., Shigenaga, M.K., and Hagen, T.M., 1993, Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging, Proc. Natl. Sci., California, pp. 79157922. Ahmed, H., 2005, Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization, CRC Press, Florida, pp. 35-42. Ali, A.A., Milala, M.A., and Gulani, I.A., 2015, Antimicrobial Effect of Crude Bromelain Extracted from Pineapple Fruit (Ananas comosus (Linn.) Merr.), Advances in Biochemistry, 3, 1-4. Backer, C.A., and Backuizen van Den Brink, Jr. R.C., 1963, Flora of Java, Vol. I, 40-56, N.V.P. Noordhoff-Gromingen, The Netherlands. Backer, C.A., and Backuizen van Den Brink, Jr. R.C., 1963, Flora of Java, Vol. III, 26-33, N.V.P. Noordhoff-Gromingen, The Netherlands. Bartholomew, D.P., Paull, R.E., and Rohrbach, K.G., 2002, The Pineapple: Botany, Production and Uses, CABI Publishing, Wallingford, p. 113. Bhattacharyya, B.K., 2008, Bromelain: An Overview, Natural Product Radiance, 7(4), 359-363. Bolton, S., and Bon, C., 2010, Pharmaceutical Statistics: Practical and Clinical Applications, Informa Healthcare, New York, pp. 82-106 Bottom, C.B., Hanna, S.S., and Siehr, D.J., 1978, Mechanism of the Ninhydrin Reaction, Biochemical Education, 6(1), 4-5. Bresolin, I.R.A.P., Bresolin, I.G.L., Silveira, G., Tambourgi, E.B., and Mazzola, P.G., 2013, Isolation and Purification of Bromelain from Waste Peel of Pineapple for Therapeutic Application, Brazilian Archives of Biology and Technology, Vol.56, n.6: pp. 971-979 Chaisawvong, N., and Sangsrichan, S., 2009, Antioxidant and Radical Scavenging Activity of Herbal Medicine Samples, Pure and Applied Chemistry International Conference, 42-44. Chaurasiya, R.S., and Hebbar, H.U., 2013, Extraction of Bromelain from Pineapple Core and Purfication by RME and Precipitation Methods, Separation and Purification Technology, 111, 90-97.

47

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 48

da Silva DIS, Nogueira GDR, Duzzioni AG, Barrozo MAS. 2013. Changes of antioxidant constituents in pineapple (Ananas comosus) residue during drying process. Indust Crops Prod 50: pp. 557–62. de Simon, B. F., Perez-Ilzarbe, J., Hernandez, T., Gomez-Cordoves C and Estrella, I. (1992), Importance of phenolic compounds for the characterization of fruit juices, J Agric Food Chem, 40, pp. 1531-1535. Dahlan, 2012, Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika, Jakarta, hal. 17 Davidek, 1997, in Macek, K., 1972, Pharmaceutical Applications of Thin Layer Chromatography, Elseiver Publishing Company, Amsterdam, London, New York, pp. 569, 608-611 Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., and Mohammad, N.S., 2009, Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and Its Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60(4), 405-412. Dennison, C., 2003, A Guide to Protein Isolation, Springer International Publishing, New York, pp. 84-88. Depkes RI, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp, 7, 1036, 1061. Englard, S. and Seifter, S., 1990, Precipitation techniques. in: Guide to protein purification, Eds. Deutscher, M.P., Academic Press, San Diego, USA Erukainure OL, Ajiboye JA, Okafor OY, Kosoko SB, Owolabi FO, Adenekan SO. Antioxidant effect of pineapple (Ananas cosmosus) peel extract on alcohol induced oxidative stress in splenic tissues of male albino rats, J Food Biochem, 2012; 36:643–7 Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S., 1995, Kimia Organik, Jilid II, edisi 3, Penerbit Erlangga, Jakarta, pp. 119-210. Gharavi,N,. Haggarty,S., dan El-Kdai, A.O.S., 2007, Chemoprotective and carcinogenic Effect of tert-Butylhydroquinone and Its Metabolites, Current Drug Metabolism, 8, 1-7 Gardner, P.T., White, T.A.C., McPhail, D.B. and G.G. Duthie. 2000. The relative contributions of vitamin C, carotenoids and phenolics to the antioxidant potential of fruit juices. Food Chemistry. 68, 471-474.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 49

Gulcin, I., Uguz, M. T., Oktay, M., Beydemir, S., & Kufrevioglu, O. I. (2004). Evaluation of the antioxidant and antimicrobial activities of clary sage (Salvia sclarea L.). Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 28, 25–33 Halliwell, B., 2012, Free Radicals and Antioxidant: Updating a Personal View, Nutrition Review, 70, 257-265. Halliwell, B., and Gutteridge, J.M.C., 2000, Free Radical in Biology and Medicine, Oxford University Press, New York, p. 34. Hatam, S.F., Suryanto, E., dan Abidjulu, J., 2013, Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak Kulit Nanas (Ananas comosus (L.) Merr), Jurnal Ilmiah Farmasi, Vol. 2:01, hal. 2302-2493. Hossain MA, Rahman SM. 2011. Total phenolics, flavonoids and antioxidant activity of tropical fruit pineapple. Food Res Intl 44(3):672–6. Ishihara, H., Takahashi, N., Oguri, S., dan Tejima, S., 1979, Complete Structure of the Carbohydrate Moiety of Stem Bromelain, The Journal of Biological Chemistry, pp. 10715-10719 Kedare, S.B., and Singh, R.P., 2011, Genesis and Development of DPPH Method of Antioxidant Assay, Journal of Food, Science, and Technology, 48(4), 412-422. Ketnawa, S., Rawdkuen, S., and Chaiwut, P., 2010, Two Phase Partitioning and Collagen Hydrolysis of Bromelain from Pineapple Peel Nang Lae Cultivar, Biochemical Engineering Journal, 52(2010), 205-211. Li, X., Xu, M., dan Chen, D., 2012, Protective Effect Against Hydroxyl-Induced DNA Damage and Antioxidant Activity of Radic bupleuri In Vitro, Spatula DD, 2(4), pp. 219-227 Manosroi, A., Chankhampan, C., Pattamapun, K., Manosroi, W., and Manosroi, J., 2014, Antioxidant and Gelatinolytic Activities of Papain from Papaya Latex and Bromelain from Pineapple Fruits, Chiang Mai J. Sci., 41(3), 635-648. Maurer, H.R., 2001, Bromelain: biochemistry pharmacology, and medical use. Cellular and Molecular Life Science, 58 1234-1245. Manzoor, Z., Nawaz, A., Mukhtar, H., and Haq, I., 2016, Bromelain: Methods of Extraction, Purification and Therapeutic Applications, Brazilian Archives of Biology and Technology, vol. 59.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 50

Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazil (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 26(2), 211-219 Morales-Gonzalez, J.A., 2013, Oxidative Stress and Chronic Degenerative Diseases: a Role for Antioxidants, Intech Publisher, Croatia, pp. 39-41. Mulja, H.M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya, pp.26-33.

Ou, B., Huang, D.J., Woodill, M.H., Flanagan, J.A., and Deemer, E.K., 2002, Analysis of Antioxidant Activities of Common Vegetables Employing Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) and Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) Assays: A Comparative Study, J. Agric. Food Chem., 50, 3122-3128. Panda, H., 2000, Herbal Cosmetics Hand Book, Asia Pasific Business Press, New Delhi, pp. 525-526 Pendzhiev, A.M., 2002, Proteolytic Enzymes of Papaya: Medicinal Applications, Pharmaceut. Chem. J., 36, 315-317. Prakash, A., Rigelhof, F., and Miller, E., 2001, Antioxidant Activity: Medallion Laboratories, Analithycal Progress, 19(2), 1-4. Rukmana, 1996, Nanas Budidaya dan Paskapanen, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, pp. 75-76. Sastrohamidjojo, H., 2001, Spektroskopi, Penerbit Liberti, Yogyakarta, hal 1-43. Soares, P.A.G., Vaz, A.F.M, Correia, M.T.S., Pessoa, A., and Carneiro-da-Cunha, M.G., 2012, Purification of Bromelain from Pineapple Wastes by Ethanol Precipitation, Separation and Purification Technology, 98, 389-395. Tjitrosoepomo, G., 1994, Taksonomi Tumbuhan Obat-Obat, 113, Universitas Gadjah Press, Yogyakarta. van Lelyveld, L.J., and de Bruyn, J.A., (1977), polyphenols ascorbic acid and related enzyme activites associated with black heart in Cayenne pineapple fruit, Agrochemophysica, 9, 1-6 Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Potensi dan Aplikasinya dalam Kesehatan, Kanisius, Yogyakarta, hal. 273-274

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 51

Zou, Y., Lu, Y., and Wei, D., 2004, Antioxidant Activity of a Flavonoid-Rich Extract of Hypericum perforatum L. in Vitro, J. Agric. Food Chem., 52, 5032-5039.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 52

LAMPIRAN Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman nanas (Ananas comosus (L.) Merr.)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 53

Lampiran 2. Gambar buah nanas

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 54

Lampiran 3. Perhitungan rendemen Bobot masing-masing kulit buah nanas yang digunakan adalah 70 gram, sehingga total bobot kulit buah nanas yang digunakan adalah 210 gram.

Berat cawan Berat cawan + ekstrak Berat ekstrak

Cawan 1 (g)

Cawan 2 (g)

Cawan 3 (g)

35,5880

38,3940

34,6945

55,2464

30,4336

35,8174

1,1005

1,0897

1,1097

Total berat ekstrak kulit buah nanas = 1,1005 g + 1,0897 g + 1,1097 g = 3,2999 g Rendemen ekstrak kulit buah nanas =

=

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑑𝑎𝑝𝑎𝑡 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑏𝑎ℎ𝑎𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑢𝑛𝑎𝑘𝑎𝑛

3,2999 𝑔𝑟𝑎𝑚 210 𝑔𝑟𝑎𝑚

= 1,5713%

×100%

×100%

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 55

Lampiran 4. Penimbangan analisis kualitatif a. Data penimbangan ekstrak kulit buah nanas Replikasi 1 (g)

Replikasi 2 (g)

Replikasi 3 (g)

Berat wadah

14,6535

13,5859

14,7843

Berat wadah + sampel

14,9091

13,5882

15,0355

Berat wadah + sisa

14,6550

13,8373

14,7868

Berat sampel

0,2541

0,2514

0,2487

b. Data penimbangan ninhidrin Ninhidrin Berat wadah

13,5739

Berat wadah + sampel

13,9238

Berat wadah + sisa

13,5744

Berat sampel

0,3494

Lampiran 5. Data penimbangan penetapan kadar protein total Replikasi 1 (g)

Replikasi 2 (g)

Replikasi 3 (g)

Berat wadah

25,8160

14,2743

23,7527

Berat wadah + sampel

26,0672

14,5256

24,0039

Berat wadah + sisa

25,8164

14,2751

23,7534

Berat sampel

0,2508

0,2505

0,2505

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 56

Lampiran 6. Optimasi penetapan kadar protein total a. Penentuan operating time (OT) bovine serum albumine pada λ = 280 nm

Waktu (Menit) 5 10 15 20 25 30

Absorbansi konsentrasi 400 µg/ml Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 0,271 0,268 0,270 0,272 0,268 0,271 0,271 0,268 0,271 0,271 0,269 0,271 0,272 0,268 0,272 0,271 0,268 0,271

OT yang diperoleh 5 menit

Waktu (Menit) 5 10 15 20 25 30

Absorbansi konsentrasi 700 µg/ml Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 0,475 0,477 0,478 0,475 0,478 0,478 0,475 0,478 0,478 0,475 0,477 0,477 0,476 0,477 0,478 0,475 0,477 0,478

OT yang diperoleh 5 menit

Waktu (Menit) 5 10 15 20 25 30

Absorbansi konsentrasi 1000 µg/ml Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 0,680 0,683 0,681 0,681 0,684 0,681 0,680 0,685 0,681 0,680 0,684 0,681 0,680 0,684 0,681 0,681 0,684 0,682

OT yang diperoleh 5 menit

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 57

b. Penentuan λ maksimum bovine serum albumine 1. Spektra bovine serum albumine 400 µg/ml

2. Spektra bovine serum albumine 700 µg/ml

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 58

3. Spektra bovine serum albumine 1000 µg/ml

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 59

Lampiran 7. Penetapan kadar protein total a. Konsentrasi bovine serum albumine 1. Konsentrasi larutan induk bovine serum albumine Replikasi 1 2 3

V1 (ml) 0,5 0,5 0,5

C1 (mg/ml) 50 50 50

V2 (ml) 25 25 25

C2 (mg/ml) 1 1 1

2. Konsentrasi seri larutan bovine serum albumine Replikasi

1

2

3

V1

C1

V2

C2

(ml)

(µg/ml)

(ml)

(µg/ml)

4

1000

10

400

5,5

1000

10

550

7

1000

10

700

8,5

1000

10

850

10

1000

10

1000

4

1000

10

400

5,5

1000

10

550

7

1000

10

700

8,5

1000

10

850

10

1000

10

1000

4

1000

10

400

5,5

1000

10

550

7

1000

10

700

8,5

1000

10

850

10

1000

10

1000

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 60

b. Kurva baku bovine serum albumine Replikasi

1

2

3

Persamaan regresi

Konsentrasi (µg/ml)

Absorbansi

400

0,273

550

0,375

y = 0,0006833x –

700

0,478

0,000533

850

0,580

r = 0,9999

1000

0,683

400

0,251

550

0,358

y = 0,0006833x –

700

0,455

0,020933

850

0,561

r = 0,9999

1000

0,662

400

0,274

550

0,371

y = 0,0006893x –

700

0,477

0,004333

850

0,585

r = 0,9998

1000

0,684

linear

Persamaan regresi linear yang digunakan adalah y = 0,0006833x – 0,000533

c. Penetapan kadar protein total larutan uji 1. Konsentrasi ekstrak kulit buah nanas Replikasi 1 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 250,8 𝑚𝑔 = = 10032 µg/ml 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 25 𝑚𝑙 Replikasi 2 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 250,5 𝑚𝑔 = = 10020 µg/ml 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 25 𝑚𝑙

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 61

Replikasi 3 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 250,5 𝑚𝑔 = = 10020 µg/ml 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 25 𝑚𝑙

2. Absorbansi ekstrak kulit buah nanas Replikasi

Absorbansi

1

0,545

2

0,531

3

0,531

3. Konsentrasi dan bobot enzim ekstrak kulit buah nanas Replikasi 1 Persamaan regresi linear y = 0,0006833x – 0,000533 0,545 = 0,0006833x – 0,000533 x = 798,380 µg/ml massa = konsenstrasi x volume = 798,380 x 25 = 19959,5 µg = 19,96 mg

Replikasi 2 Persamaan regresi linear y = 0,0006833x – 0,000533 0,531 = 0,0006833x – 0,000533 x = 777,891 µg/ml

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 62

massa = konsentrasi x volume = 777,891 x 25 = 19447,27 µg = 19,44 m

Replikasi 3 Persamaan regresi linear y = 0,0006833x – 0,000533 0,531 = 0,0006833x – 0,000533 x = 777,891 µg/ml massa = konsentrasi x volume = 777,891 x 25 = 19447,27 µg = 19,44 mg

4. Kadar enzim ekstrak kulit buah nanas 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚

Persentase enzim = 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 ×100% Replikasi 1 19,96

Persentase enzim = 250,8 ×100% = 7,95% Replikasi 2 19,44

Persentase enzim = 250,5 ×100% = 7,76% Replikasi 3 19,44

Persentase enzim = 250,5 ×100% = 7,76%

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 63

1

Bobot enzim (mg) 19,96

Bobot ekstrak (mg) 250,8

Kadar Enzim (%) b/b 7,95

2

19,44

250,5

7,76

3

19,44

250,5

7,76

Replikasi

x ± SD

7.8233 ± 0,1096

Lampiran 8. Penimbangan pengujian aktivitas antioksidan a. Data penimbangan DPPH Replikasi 1 (g)

Replikasi 2 (g)

Replikasi 3 (g)

Berat wadah

14,2743

13,5727

13,5835

Berat wadah + sampel

14,2902

13,5885

13,5996

Berat wadah + sisa

14,2744

13,5727

13,5837

Berat sampel

0,0158

0,0158

0,0159

Replikasi 1 (g)

Replikasi 2 (g)

Replikasi 3 (g)

Berat wadah

14,2743

13,5727

13,5835

Berat wadah + sampel

14,2793

13,5779

13,5885

Berat wadah + sisa

14,2743

13,5729

13,5836

Berat sampel

0,0050

0,0050

0,0049

b. Data penimbangan rutin

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 64

c. Data penimbangan ekstrak kulit buah nanas Replikasi 1 (g)

Replikasi 2 (g)

Replikasi 3 (g)

Berat wadah

14,3645

23,8360

20,5345

Berat wadah + sampel

14,6155

24,0875

20,7858

Berat wadah + sisa

14,3650

23,8375

20,5358

Berat sampel

0,2505

0,2500

0,2500

Lampiran 9. Perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding, dan larutan uji a. Konsentrasi DPPH 1. Replikasi 1 BM = 394,33 Mol = M

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝐵𝑀

=

15,8 𝑚𝑔 394,33

𝑚𝑜𝑙

= 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 =

= 0,0401 mmol

0,0401 𝑚𝑚𝑜𝑙 0,1 𝐿

= 0,4010 mM

2. Replikasi 2 BM = 394,33 Mol = M

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝐵𝑀

=

15,8 𝑚𝑔 394,33

𝑚𝑜𝑙

= 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 =

= 0,0401 mmol

0,0401 𝑚𝑚𝑜𝑙 0,1 𝐿

= 0,4010 mM

3. Replikasi 3 BM = 394,33 Mol = M

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝐵𝑀 𝑚𝑜𝑙

=

15,9 𝑚𝑔

= 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 =

394,33

= 0,0403 mmol

0,0403 𝑚𝑚𝑜𝑙 0,1 𝐿

= 0,4030 mM

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 65

b. Konsentrasi rutin 1. Konsentrasi larutan induk Replikasi 1 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒

5,0 𝑚𝑔

= 100 𝑚𝑙 = 50 µg/ml

Replikasi 2 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒

5,0 𝑚𝑔

= 100 𝑚𝑙 = 50 µg/ml

Replikasi 3 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒

4,9 𝑚𝑔

= 100 𝑚𝑙 = 49 µg/ml

2. Konsentrasi seri larutan baku rutin Replikasi

1

2

3

V1 (ml) 2 3 4 5 6 2 3 4 5 6 2 3 4 5 6

C1 (µg/ml) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 49 49 49 49 49

V2 (ml) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

C2 (µg/ml) 10 15 20 25 30 10 15 20 25 30 9,8 14,7 19,6 24,5 29,4

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 66

c. Konsentrasi ekstrak kulit buah nanas 1. Konsentrasi larutan induk Replikasi 1 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒

=

250,5 𝑚𝑔 25 𝑚𝑙

= 10,02 mg/ml

Replikasi 2 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒

=

250 𝑚𝑔 25 𝑚𝑙

= 10,00 mg/ml

Replikasi 3 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒

=

250 𝑚𝑔 25 𝑚𝑙

= 10,00 mg/ml

2. Konsentrasi seri larutan uji Replikasi

1

2

3

V1 (ml) 3 3,5 4 4,5 5 3 3,5 4 4,5 5 3 3,5 4 4,5 5

C1 (mg/ml) 10,020 10,020 10,020 10,020 10,020 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000

V2 (ml) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

C2 (mg/ml) 3,006 3,507 4,008 4,509 5,010 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 67

Lampiran 10. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a. Penentuan operating time (OT) rutin pada λ = 517 nm

Waktu (Menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Absorbansi konsentrasi 5 µg/ml Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 0,812 0,811 0,816 0,793 0,903 0,797 0,787 0,796 0,790 0,782 0,791 0,785 0,780 0,787 0,783 0,780 0,783 0,781 0,780 0,783 0,781 0,781 0,782 0,779 0,781 0,782 0,780 0,782 0,783 0,781 0,785 0,782 0,783 0,788 0,785 0,785

OT yang diperoleh 30 menit

Waktu (Menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Absorbansi konsentrasi 15 µg/ml Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 0,681 0,689 0,680 0,641 0,662 0,651 0,619 0,638 0,628 0,607 0,620 0,609 0,599 0,605 0,596 0,593 0,605 0,584 0,593 0,605 0,584 0,590 0,600 0,581 0,585 0,595 0,574 0,581 0,587 0,570 0,582 0,568 0,579 0,577 0,568 0,578

OT yang diperoleh 30 menit

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 68

Waktu (Menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Absorbansi konsentrasi 25 µg/ml Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 0,518 0,503 0,510 0,501 0,511 0,499 0,493 0,483 0,463 0,453 0,451 0,438 0,429 0,426 0,409 0,398 0,408 0,410 0,397 0,394 0,399 0,397 0,381 0,394 0,393 0,381 0,389 0,389 0,375 0,386 0,372 0,382 0,386 0,369 0,375 0,380

OT yang diperoleh 30 menit b. Penentuan λ maksimum 1. Spektra DPPH 0,020 mM

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 69

2. Spektra DPPH 0,040 Mm

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 70

3. Spektra DPPH 0,060 mM

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 71

Lampiran 11. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH %IC =

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙

×100%

a. Rutin

Replikasi

1

2

3

Konsentrasi (µg/ml) 10 15 20 25 30 10 15 20 25 30 9,8 14,7 19,6 24,5 29,4

Absorbansi Absorbansi kontrol larutan DPPH pembanding 0,716 0,635 0,805 0,554 0,468 0,384 0,710 0,631 0,810 0,538 0,450 0,368 0,705 0,630 0,798 0,541 0,451 0,365

%IC 11,0559 21,1180 31,1801 41,8633 52,2981 12,4221 22,2360 33,7888 44,4444 54,5679 11,6541 21,0526 32,2055 43,4837 54,2606

Persamaan regresi linear y= 2,0646x – 9,7888 r = 0,9999 y = 2,13x – 9,1082 r = 0,9997 y= 2,1529x – 10,5263 r = 0,9995

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 72

b. Ekstrak kulit buah nanas

Replikasi

1

2

3

Konsentrasi (mg/ml) 3,006 3,507 4,008 4,509 5,010 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0

Absorbansi Absorbansi kontrol larutan DPPH pembanding 0,595 0,552 0,868 0,501 0,465 0,415 0,601 0,557 0,861 0,513 0,469 0,422 0,609 0,560 0,874 0,518 0,468 0,425

%IC 31,4516 36,4055 41,0138 46,4287 52,1889 29,9539 35,3077 40,4181 45,5284 50,9872 30,3203 35,9267 40,7322 46,4530 51,3729

Persamaan regresi linear y= 10,2790x + 0,2994 r = 0,9990 y= 10,4574x 1,3907 r = 0,9999 y= 10,5263x 1,1441 r = 0,9996

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 73

Lampiran 12. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak kulit buah nanas a. Rutin Replikasi 1 Persamaan regresi linear y

= 2,0646x – 9,7888

50 = 2,0646x – 9,7888 x

= 28,9591 µg/ml

Replikasi 2 Persamaan regresi linear y

= 2,13x – 9,1082

50 = 2,13x – 9,1082 x

= 27,7503 µg/ml

Replikasi 3 Persamaan regresi linear y

= 2,1529x – 10,5263

50 = 2,1529x – 10,5263 x

= 28,1138 µg/ml

Replikasi

Persamaan regresi linear

y IC50

X (nilai IC50)

µg/ml 1

y = 2,0646x – 9,7888

50

28,9591

2

y = 2,13x – 9,1082

50

27,7503

3

y = 2,1529x – 10,5263

50

28,1138

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 74

Replikasi

IC50

1

28,9591

2

27,7503

3

28,1138

SD

X (µg/ml)

X ± SD

0,6202

28,2744

28,2744 ± 0,6202

b. Ekstrak kulit buah nanas Replikasi 1 Persamaan regresi linear y

= 10,2790x + 0,2994

50 = 10,2790x + 0,2994 x

= 4,8351 mg/ml = 4835,1 µg/ml

Replikasi 2 Persamaan regresi linear y

= 10,4574x - 1,3907

50 = 10,4574x - 1,3907 x

= 4,9142 mg/ml = 4914,2 µg/ml

Replikasi 3 Persamaan regresi linear y

= 10,5263x - 1,1441

50 = 10,5263x - 1,1441 x

= 4,8586 mg/ml = 4858,6 µg/ml

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 75

Replikasi

Persamaan regresi linear

y IC50

X (nilai IC50)

µg/ml 1

y = 10,2790x + 0,2994

50

4835,1

2

y = 10,4574x - 1,3907

50

4914,2

3

y = 10,5263x - 1,1441

50

4858,6

Replikasi

IC50

1

4835,1

2

4914,2

3

4858,6

SD

X ( µg/ml)

X ± SD

28,2744

4869,3

4869,3 ± 28,2744

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 76

Lampiran 13. Uji statistik

a. Uji normalitas (Shapiro-Wilk Test)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 77

Hipotesis null (H0)

= data terdistribusi normal

Hipotesis alternatif (H1)

= data tidak terdistribusi normal

Taraf kepercayaan 95% Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak dan H1 diterima Jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak dan H0 diterima Data IC50 rutin dan ekstrak bromelain kulit buah nanas terdistribusi normal karena p-value rutin = 0,568 dan p-value ekstrak bromelain kulit buah nanas = 0,5605. Jadi, H1 ditolak dan H0 diterima sehingga kesimpulannya adalah data terdistribusi normal.

b. Uji varian data

Hipotesis null (H0)

= varian data tidak berbeda signifikan (homogen)

Hipotesis alternatif (H1)

= varian data berbeda signifikan (tidak homogen)

Taraf kepercayaan 95% Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak dan H1 diterima Jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak dan H0 diterima

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 78

Varian data IC50 rutin dan ekstrak bromelain kulit buah nanas tidak homogen, karena p-value = 0,008543. Jadi, H0 ditolak dan H1 diterima sehingga kesimpulannya adalah varian data berbeda signifikan atau tidak homogen.

c. Uji hipotesis

Hipotesis null (H0)

= data tidak berbeda signifikan

Hipotesis alternatif (H1)

= data berbeda signifikan

Taraf kepercayaan 95% Jika t’ kurang dari t maka H1 ditolak dan H0 diterima Jika t’ tidak kurang dari t maka H0 ditolak dan H1 diterima Data IC50 rutin dan ekstrak bromelain kulit buah nanas berbeda secara signifikan, karena t’ = 4,302 dan t = 206,39. Jadi, H1 ditolak dan H0 diterima sehingga kesimpulannya adalah data tidak berbeda signifikan.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 79

Lampiran 14. Tabel t-distributions

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan dan Penetapan Kadar Protein Total Ekstrak Kulit Buah Nanas (Ananas comosus L. Merr)” ini memiliki nama lengkap Yohanes Bintang Pambudi. Dilahirkan di kota Bantul pada tanggal 15 Mei 1993 dari pasangan Antonius Suripto dan Endang Nurhandayani. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK Angkasa Adisucipto Yogyakarta pada tahun 1997 hingga 1999, kemudian melanjutkan pendidikan dasar di SD Kanisius Baciro pada tahun 1999 hingga 2005, pendidikan menengah di SMP Pangudi Luhur 2 Yogyakarta pada tahun 2005 hingga 2008 dan SMA Pangudi Luhur van Lith Muntilan pada tahun 2008 hingga 2011. Penulis kemudian melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2012 hingga 2016. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, penulis cukup aktif dalam kegiatan kemahasiswaan, kepanitiaan dan kegiatan lain. Penulis cukup aktif dalam Jaringan Mahasiswa Kesehatan Indonesia (JMKI) Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta sebagai Humas periode 2012-2013. Penulis juga cukup aktif dalam kegiatan kepanitiaan, antara lain : Panitia TITRASI periode 2013 dan 2014, Panitia Pelepasan Wisuda (2014), Panitia Pharmacy Performance dan Road to School (2013).

80