10 Abril Anticuerpos.pdf

ANTICUERPOS Efectores de la respuesta inmune humoral

INMUNOLOGIA (3077) Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales Dpto. de Microbiología e Inmunología Inmunología 2018 Universidad Nacional de Río Cuarto

Dra. NOEMI RODRIGUEZ

Objetivos de aprendizaje

 Describir la estructura de las inmunoglobulinas  Analizar sus funciones biológicas  Estudiar los genes involucrados en la síntesis y los mecanismos de recombinación y conmutación en la diferenciación de los isotipos

RESPUESTA EFECTORA HUMORAL

Anticuerpos (Ac): moléculas de Inmunoglobulinas (Ig) secretadas por células plasmáticas

Inmunoglobulina glucoproteína

 Dos

cadenas polipeptídicas globulares pesadas (H)  Dos cadenas polipeptídicas livianas (L) unidas entre sí por puentes disulfuro

Generalidades  Proteínas de estructura globular sintetizadas por células del sistema inmune (células plasmáticas derivadas de LB).  Presentes en sangre (plasma) y otros fluidos biológicos (saliva, lágrimas, secreción mucosa intestinal, líquido sinovial, líquido intersticial etc.)  En el plasma se detectan dentro de la fracción de las γ globulinas.  Capaces de reconocer Ag de manera muy específica y formar complejos estables (inmunocomplejos).  Son los efectores de la respuesta inmune humoral.  Los Ac tienen una vida media relativamente larga (varias semanas).  Constituyen una defensa muy eficaz contra agentes patógenos.

Características principales

* Especificidad * Afinidad * Capacidad de dirigir los mecanismos biológicos efectores de la RI humoral

Estructura de una inmunoglobulina

Glucoproteínas formadas por cuatro cadenas polipeptídicas 2 cadenas livianas L (Light: Liviana) idénticas (PM: 23- 26 kDa) 2 cadenas pesadas H (Heavy: pesado) idénticas (PM: 55-77 kDa) Cada cadena presenta una zona constante (C) y una variable (V).

Región bisagra: formada por un a.a. prolina, localizada en la cadena H, entre CH1-CH2; permite la movilidad a las Ig (también susceptibilidad a proteasas) Las cadenas H se unen entre si por puentes disulfuro y a L por otro puente disulfuro. Variabilidad de la región V: es la razón de la gran diversidad de especificidades de unión al Ag

La Ig completa es bivalente con dos sitios idénticos de unión al antígeno

Esquema de la estructura de una inmunoglobulina Zona hipervariable: CDR1, CDR2 y CDR3 (ubicada en zona V. Región determinante de Complementariedad-10 a 15 a.a.). Conforman el PARATOPE (Rc idiotípico), responsable de la unión con el epitope (Ag)

Región de unión al C´ Región de unión al Rc Fc Dominio de Ig

Dominios: estructuras proteicas conservadas 100-110 a.a., muy compacto y estable. Cadenas L: 2 dominios: 1 variable (VL) y otro constante (CL). Cadenas H: región variable (VH) y tres (IgG e IgA) o cuatro (IgM e IgE) constantes (CH1, CH2, CH3 y CH4). H de C: región C de cadenas H (CH2 y región bisagra). Su función no está clara (parece ligado al catabolismo y alguna de sus funciones, como la capacidad para unir Rc celulares y activar C´)

Esquema de la fragmentación de Ig por acción de enzimas Digestión por proteasas (pepsina o papaína): escinde a la Ig en fragmentos:  Fragmento Fab (antigen binding Fragment): 1 dominio C y 1 V de una cadena H y de una cadena L. Reside la especificidad de la Ig (capacidad para reaccionar con el Ag).  Fragmento Fc (Crystalizable Fragment): dominios C de cadenas H, determina funciones biológicas o efectoras en las Ig (fijación del C´, Rc celulares, etc.) Papaína rompe a las Ig en 2 fragmentos F(ab) y uno F(c)  Pepsina rompe a las Ig en 1 fragmento F(ab)´2 y 1 F(c).

2 Fab

Fab

1 Fc

Fc

pepsina

1 F(ab)2´ 1 Fc

Estructura de las Inmunoglobulinas Estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. Cuaternaria: permite sus dos funciones: unión al Ag y actividad biológica efectora. V

C

Cadenas L: región V (VL amino-terminal) y región C (CL carboxi-terminal). Dos tipos posibles de cadenas L:  (cappa) y  (lambda), según variantes en la región C. En una misma Ig existen dos cadenas  o dos cadenas  , pero nunca una de cada tipo.

V

C

C

C

Cadenas H: cada una posee una región variable (VH aminoterminal 100-110 a.a.). El resto de la cadena muestra cinco patrones de secuencia que configuran cinco tipos de cadenas H según la porción C (CH). Cada tipo de cadena H recibe como denominación una letra griega y determinan la clase o isotipo de Igs. Cada isotipo de cadena H puede combinarse por separado con cada tipo ( o ) de cadenas L.

Isotipos y determinantes isotípicos Determinantes isotípicos: determinantes antigénicos que caracterizan las clases y subclases de las cadenas H y tipos y subtipos de las cadenas L. Isotipo (clase): conjunto de variantes de Igs comunes a todos los miembros de una especie. Son variaciones en regiones C tanto de cadenas H como de cadenas L. En determinados casos se pueden diferenciar subclases. 5 clases o isotipos según las porciones C de cadenas H: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE Cada isotipo (y subclase) es determinado por un gen de CH: Cμ, Cδ, Cα, Cε y Cγ. Todos los individuos de una especie tienen el mismo juego de genes de regiones C. Cada isotipo CH tiene dos versiones: κ o λ de CL

Cκ

Cκ

Cγ

Cμ

Alotipos y determinantes alotípicos Determinantes alotípicos: determinantes antigénicos específicos de las formas alélicas de los genes de Ig. Alotipos: pequeñas diferencias en la secuencia de a.a. en la región CL y CH producidas por distintos individuos de una especie (se heredan): son variaciones individuales dentro de una especie (individuos que presentan una variante alélica distinta a la de otros individuos; presentes solo en algunos individuos sanos de la especie)

Idiotipos y determinantes idiotípicos Determinantes idiotípicos: determinantes antigénicos presentes en moléculas individuales de Ac o sobre moléculas de especificidad idéntica. Idiotipo: conjunto de variantes antigénicas características de cada Ac de un mismo individuo, debidas a las secuencias de aminoácidos de las porciones VH y VL. El idiotipo puede coincidir o no con un paratope . Ac producidos por un clon de LB y células plasmáticas derivadas de ellos llevan el mismo idiotipo. Tienen un papel importante en la regulación de la respuesta inmune.

REACCIONAR CON LOS Ag: facilita su eliminación (inactivar al microorganismo o hacerlo susceptible a la destrucción por otros componentes del sistema inmune).  Cada Ac es específico: sólo puede unirse a un Ag o nº pequeño de Ag diferentes. 

Las Ig reaccionan con el Ag de dos formas:  Unidas al LB: BCR (receptor para Ag del LB). Les permite reaccionar con el Ag en su forma nativa.  Libres en fluidos. Posibilita que las Ig tengan distintas funciones biológicas:      

Fab Fc

Activación del complemento Aglutinación Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos Neutralización Opsonización Protección de mucosas

sitio de unión con el Ag induce activación del C´ y la unión al RcFc de células efectoras: monocitos, macrófagos, neutrófilos y NK

Diferentes clases (isotipos) funcionan en distintos compartimentos corporales (sangre, tejidos y superficies mucosas están protegidas por los Ac)

Funciones efectoras de los Ac.

 

 

Los Ac dirigidos contra microorganismos (y sus toxinas) neutralizan a estos agentes, los opsonizan para la fagocitosis, los sensibilizan para la ADCC activan el Complemento. Estas diversas funciones efectoras pueden estar mediadas por isotipos diferentes

Neutralización de microorganismos y toxinas IgG e IgA pueden neutralizar toxinas e inhibir la infectividad de los virus

A- los Ac impiden la unión de los microorganismos a las células: bloquean su capacidad de infectar células del huésped.

B- los Ac inhiben la propagación de microorganismos: desde una célula infectada a otra adyacente sin infectar.

C- los Ac bloquean la unión de toxinas a las células: inhiben los efectos patológicos de las toxinas.

Opsonización mediada por Ac y fagocitosis del microorganismo

IgG se une a microorganismos y después es reconocida por RcFc de fagocitos: Las señales de los Rc promueven la fagocitosis de los microorganismos opsonizados y activan los fagocitos para que los destruyan. Receptores para opsoninas: RFcγ-I y RFcγ-IIA (macrófagos, neutrófilos, eosinófilos): fagocitosis.

Citotoxicidad dependiente de Acs

IgG se une a células infectadas y las regiones Fc de los Ac unidos son reconocidas por un RcFcγ (CD16) de NK. Estas células se activan y matan a las células cubiertas de Ac

Mecanismo de eliminación de helmintos mediado por IgE y eosinófilos.

RFcγ-IIIA (CD16) (NK: ADCC). RFcε (mastocitos, basófilos, eosinófilos: degranulación)

CLASES DE INMUNOGLOBULINAS  IgM, IgG, IgA, IgE e IgD

 Están determinadas por los isotipos de las cadenas CH: μ, α, γ, δ o ε.  Las cadenas livianas (CL) pueden ser kappa (κ) o lambda (λ).  Las distintas clases de inmunoglobulinas presentan diversas

funciones biológicas.

Subclases de Ig en los principales mamíferos domésticos

 Estructura molecular: monómero.  Representa entre 80-85% de las Ig en suero y calostro (la más

abundante en suero).  La producen células plasmáticas de bazo, ganglios linfáticos y medula ósea.  Es la más pequeña, PM 180 kDa.  Son las únicas que atraviesan placenta en primates y roedores (menor en perros y gatos).  Son las más características de la RESPUESTA INMUNE SECUNDARIA.  Subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 (hombre y diversas en otras especies).  Funciones

 Neutralizan toxinas y micoorganismos.

 Activan vía clásica del C´  Capacidad para activar procesos inflamatorios mediante unión a receptores

celulares (FcγR)  Fagocitosis por macrófagos, neutrófilos  Citotoxicidad celular dependiente de Ac por células NK

Inmunoglobulina G (IgG)

Sitio de unión con el Ag

Sitio de unión con el Ag

Bivalente

Inmunoglobulina M (IgM)  Pentámero: 5 monómeros de Ig unidos por cadena J (péptido).  Presente en plasma. Segunda en concentración. PM 900 kDa.  Diez sitios de unión con Ag (multivalente).  Secretada en RESPUESTA INMUNE PRIMARIA (y Ag T-independientes).  Potente fijadora del C´ (5 fragmentos Fc que unen al componente C1q).  Presente como monómero en la membrana de LB (Rc. antigénico de LB: BCR)  Presente en la mayor parte de los mamíferos.

 No tiene región bisagra.  El 2-Mercaptoetanol (2-ME) cliva la molécula en 5 monómeros (importancia

en el Inmunodiagnóstico). Funciones  Primera Ig de defensa en la respuesta humoral y aunque su grado de afinidad para reaccionar con el Ag es inferior al de la IgG, su formación pentamérica le permite unirse de forma múltiple con Ag.  Activador de la vía clásica del Complemento  Opsonización  Efectiva frente a bacterias Gram negativas y puede neutralizar agentes virales.

Inmunoglobulina M (IgM)

.

 Dímero: 2 unidades básicas unidas por un componente

secretor (S) que la protege de la acción de enzimas proteolíticas de las secreciones y una cadena J.  Peso molecular: 360 kDa.  De mayor relevancia en las secreciones externas: mucosas, piel, glándula mamaria.  Importante en la inmunidad del recién nacido.  Se sintetiza en RESPUESTA INMUNE SECUNDARIA.  Subclases  IgA1 (IgA sérica): monómero sérico.

• Facilita fagocitosis: FcαR se expresa en macrófagos, neutrófilos.

 IgA2 (IgAs- IgA secretora): dímero unido por cadena J. Presente en

saliva, lágrimas, leche materna, secreciones respiratoria, digestiva y vaginal • Evita la adhesión de Ag a superficies corporales (impide el ingreso de microorganismos y macromoléculas al organismo). • Neutraliza toxinas en la mucosa. • No fija C´ ni es opsonina.

Inmunoglobulina A (IgA)

Bisagra

Cadena J

Monómeros

Mecanismo de síntesis de la IgAs  Se secreta como dímero asociado con una cadena J.  Secretada por células plasmáticas de la lámina propia (epitelio intestinal,

respiratorio, glándulas lagrimales y salivales y glándula mamaria lactante).  IgA es transportada a través del epitelio hasta su superficie (lumen intestinal o bronquial).  El dímero-cadena J difunde a través de la membrana basal y se une al Rc poli-Ig en la superficie basolateral de la célula epitelial.  El complejo Rc poli-Ig-IgA dimérica, se interioriza y es llevado a través del citoplasma de la célula epitelial dentro de una vesícula de transporte hacia la superficie apical (transcitosis).  En la superficie el Rc se rompe enzimáticamente, libera la porción extracelular del Rc unido a Fc de IgA. Este fragmento Rc, componente secretor, protege la IgA dimérica de digestiones proteolíticas.  Algunas moléculas de IgA difunden desde lamina propia a espacios extracelulares de tejidos que drenan al torrente sanguíneo.  Función principal: proteger la superficie epitelial de los agentes infecciosos.  Impide unión de bacterias o toxinas a células epiteliales o absorción de sustancias externas; 1º línea de defensa contra amplia variedad de patógenos.

Esquema del mecanismo de síntesis de IgAs Exclusión inmune de las superficies mucosas

Neutralización de virus

Neutralización de endotoxinas (LPS). GAclaramiento de Ag que hayan pasado la barrera intestinal

Esquema de los mecanismos de acción de la IgAs

 Monómero: con 4 dominios C en la cadena H (CH1-CH4).  Su concentración en suero es baja (aumentada en procesos alérgicos).  No activa el sistema C´.  En condiciones fisiológicas tiene un papel importante en la inmunidad contra

parásitos: interviene en la respuesta inmune protectora, especialmente hacia helmintos (protección frente a infecciones parasitarias por activación de mastocitos o eosinófilos).

Inmunoglobulina D (Ig D)

 Se presenta en forma de monómero.  Constituye menos del 1% del total de Ig circulantes.  No existe en todas las especies, únicamente en primates y    

roedores. Es básicamente un BCR (constitutiva de la membrana de LB)). IgD no se secreta Se coexpresa con la IgM de superficie del LB No está claro su papel en respuesta inmune humoral.

Inmunoglobulina Y  Monomérica, de PM de 180 kDa (algo mayor que IgG mamífera; la cadena 

 





H contiene un dominio C adicional y mayor cantidad de H de C). Carece de la región de bisagra que le otorga la flexibilidad a la IgG mamífera. Las características funcionales de la IgY son homólogas a la IgG de los mamíferos, incluyendo su papel en la respuesta inmune secundaria. En el suero de las aves galliniformes (pollos y pavos) IgY tiene la estructura de una Ig convencional: 2 cadenas pesadas (H) y 2 cadenas livianas (L). En el suero de patos y gansos coexisten dos isoformas de IgY: una forma completa y una forma truncada a la que le falta la región Fc, por lo que esta isoforma no activa el C´ni promueve la opsonización. La IgY se transfiere activamente desde el suero a la yema de huevo mediante un proceso que involucra un receptor para la porción Fc, por lo tanto luego de la inmunización es posible encontrar de 100 a 200 mg de IgY por huevo.

Principales características de la IgY

Esquema de una IgY

La transferencia de la IgY a la yema ocurre por un proceso activo donde los ovocitos captan mediante receptores específicos la IgY sérica. Este proceso tarda aproximadamente 5 días en realizarse.

Síntesis de Inmunoglobulinas

 Las células plasmáticas, derivadas de los Linfocitos B activados luego del

reconocimiento de Ag, tienen capacidad para sintetizar y secretar Ig en grandes cantidades.  La síntesis de Ig se lleva a cabo en los ribosomas de estas células, donde tiene lugar la traducción de mRNA correspondiente a las 4 cadenas peptídicas.  Posteriormente se produce el proceso de la glucosilación de dichas cadenas y la secreción de las mismas.  Síntesis de cadenas L y H: regulada por genes presentes en cromosomas distintos.

Los genes que codifican las cadenas L y H están en cromosomas diferentes

Cadena L: segmentos génicos variables V y de unión J. Se combinan para codificar la región V de una cadena L

Región V: codificada por 2 (VL) o 3 (VH) segmentos génicos que requieren un reordenamiento productivo para que pueda transcribirse.

Cadena H: un segmento génico de diversidad D entre V y J. Se combinan V, D y J para codificar la región V de la cadena H

Región C: en el locus de cadena H hay genes para los diferentes isotipos de Ig.

REORDENAMIENTO DE SEGMENTOS GÉNICOS DE LAS Ig

LB maduro tiene genes de L y H ya reagrupados y sólo podrá producir un determinado tipo de Ac.

Reordenamiento de genes de cadenas L Participan los segmentos génicos V, J y C (no hay genes D). Proceso de recombinación de genes: se acopla un segmento V con uno J. El conjunto V/J se recombina con el segmento correspondiente a la región CL (Cκ o Cλ). La transcripción genera un RNAm que contiene información secuenciada V, J y C. Reordenamiento de genes de cadenas H Participan los segmentos génicos V, D, J, y C. 1- Se produce la recombinación entre un segmento D y uno J. 2- D/J se recombina con un segmento V. 3- El complejo V/D/J se puede recombinar con cada uno de los segmentos que codifican las regiones C, según el isotipo a formar (Cμ; Cδ; Cγ, etc). El proceso de recombinación con los genes C tiene lugar a nivel de RNA LB en reposo (naive) contiene la información de V/D/J más la de los genes Cμ y Cδ, (originan IgM o IgD). Este mecanismo es el responsable de que en los LB en reposo se expresen simultáneamente ambas Ig.

Los genes de la región C de la cadena H se encuentran juntos en un cromosoma

Esquema del reordenamiento de los segmentos génicos de cadenas pesadas de las Ig

En las distintas fases de la RI humoral pueden producirse diferentes clases de Ig

Cambio de clase de las inmunoglobulinas Cuando LB reconoce Ag, secreta IgM (Respuesta 1ria). Otros LB comienzan a producir IgG, IgA o IgE, lo que significa que los LB pueden cambiar la clase o isotipo de las Ig: se generan Ac que mantienen la región V (especificidad antigénica), pero con segmentos constantes diferentes. El cambio (conmuntación) de clase de Ig sólo ocurre en una respuesta secundaria. Conmutación de clase  Permite la producción de distintas clases de Ac (IgA, IgE, o IgG), definidas por la región C de la cadena H (sólo cambia la región C de la cadena H) .  El isotipo generado depende del tipo de citoquinas presentes en el entorno del LB.  Ocurre en la cadena H por recombinación de conmutación de clase ("class switch

recombination" o CSR): se basa en secuencias de nucleótidos conservadas, llamadas regiones de conmutación (regiones switch o S), presentes en un punto anterior a los genes de la región C. El ADN se escinde por ciertas enzimas en dos regiones S concretas.  El exón del dominio V se vuelve a la región C elegida (γ, α o ε), lo forma un gen de Ig que codifica un Ac de un isotipo diferente.

Mecanismos del cambio de isotipo de cadena pesada (switching)

LB producen IgM en Rta. Primaria (sin estímulo de LTh). Cuando LB reciben señales del LTh, realizan un cambio a otro isotipo Ig (ej, IgE). Estos estímulos inician la transcripción en línea germinal a través del locus IεSε-Cε. Los genes de CH proximales se eliminan en un círculo de ADN, lo que lleva a la recombinación de VDJ con el gen Cε. Las regiones de cambio se indican por círculos etiquetados Sμ o Sγ. Representan el lugar de inicio para la transcripción de la línea germinal.

Esquema del cambio de isotipo de cadena pesada de Ig

Los LB activados por las señales del LT cooperador presentan un cambio a un isotipo diferente, que median distintas funciones efectoras. Se muestran ejemplos seleccionados de isotipos cambiados.

Fases finales de la síntesis de inmunoglobulinas Una vez reagrupados los segmentos, se produce un solo mARN, que abandona el núcleo dirigiéndose al RER, donde comienza su traducción. Luego se produce el ensamblaje, cuyo proceso es el siguiente H+H → H2+L → H2L2. IgM une primero una cadena H con una L. Su destino final, como receptor (BcR) o bien para ser secretada, depende si posee o no un fragmento añadido de 19 a.a. en la región C-terminal. Su presencia determina una región hidrofóbica capaz de anclarse a la membrana celular.

BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA

• • • • • • • •

•

Tizard, I. Introducción a la Inmunología Veterinaria. Ed. Elsevier. 8º edición. 2009 Gutiérrez Pabello, J. A. Inmunología veterinaria. Ed. El Manual Moderno, México. 2010 Abbas, A., Lichtman, A., Pillai, S. Inmunología celular y molecular. Editorial Elsevier, España, 8º ed. 2016 Margni, R.A. Inmunología e Inmunoquímica. Ed. Médica Panamericana. 5º ed. Bs As, 1996. Delves, P.; Martin, S.; Burton, D.; Roitt, I. INMUNOLOGÍA. Fundamentos. Ed. Médica Panamericana, 12º ed. México 2014. Parham, P. INMUNOLOGÍA. Ed. Médica Panamericana, 2º ed. 2006 Fainboim, L. y Geffner, J. Introducción a la Inmunología humana. Ed. Médica Panamericana, 6º ed. 2010 Janeway, C.; Travers, P.; Walport, M.; Capra, J. D. Inmunobiología. Ed. Masson et Cie. 2000 Bases de datos y bibliotecas electrónicas