04-04-08 I Vaccini

I vaccini: metodiche di preparazione

I vaccini

Risposta immunitaria specifica indotta (ANTICORPO MEDIATA)

INNESCO DELLA RISPOSTA ANTICORPALE Citochine attive sui B

Alcuni diventano linfocitI B memoria

Attivazione e differenziazione Anticorpi

Legame con il B Antigene rilasciato

Cellula secernente anticorpi

Risposta immunitaria specifica indotta (CELLULO-MEDIATA)

Attivazione di T citotossici

Plasmide con vaccino a DNA

Proliferazione e attacco

Segnali di “killing”

Gene eterologo Cellula ricevente Citochine favorenti l’attivazione

T citotossici attivati

Tipi di vaccini • Batterici • Viventi attenuati: BCG, antitifo orale • Uccisi: antipertosse, colera • Anatossine: antidifterico, antitetanico • Antigeni di superficie: antipneumo e meningococco

• Virali • Viventi attenuati: antipolio orale, antirosolia, antimorbillo, antiparotite, antiamarillico • Uccisi, completi: antinfluenzale, antipolio iniettabile, antirabbico • Antigeni di superficie: anti HBV

Costituzione dei vaccini • Vivi attenuati (virus o batteri). Virali: vaccino orale di Sabin, MPR; batterici: BCG, Ty 21a • Uccisi (virus o batteri) con mezzi fisici o chimici rispettando l’integrità antigenica. Esempi: antirabbico, antipolio di Salk antinfluenzale, antipertosse • Frazioni di microrganismi: costituiti da virus frammentati (SPLIT), così allestiti per ovviare a reazioni indesiderate

•Antigeni purificati: i vaccini antinfluenzali a subunità come EMOAGGLUTININA E NEURAMINIDASI. • Anatossine: esotossine trattate ma che mantengono potere antigenico: bacillo difterico e tetanico • Anti-idiotipo: i vaccini anti-idiotipo proteici utilizzano come antigene tumore-specifico l’immunoglubulina prodotta dalle cellule neoplastiche, la quale viene iniettata nel paziente al fine di immunizzarlo contro il suo stesso tumore. Manipolazioni genetiche

Nei vaccini i virus possono essere attenuati

Nei vaccini i virus possono essere attenuati

Linea cellulare di packaging

Usi del DNA ricombinante: PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO ESPRESSE IN SISTEMI RICOSTITUITI:

Vantaggi - SISTEMI DI ESPRESSIONE MOLTO SEMPLICI DA MANIPOLARE - PRODUZIONE DI PROTEINE IN GRANDI QUANTITA’ E A BASSO COSTO - RISCHIO CONTAMINAZIONE VIRALE NULLO -RISCHIO ALLERGIE RIDOTTO RISPETTO ALLA PURIFICAZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE

Problemi -E’ DIFFICILE OTTENERE PROTEINE DA USARE COME ANTIGENE CHE MANTENGANO LA CONFORMAZIONE NATIVA DELLE PROTEINE UMANE (i sistemi di folding dei batteri sono molto meno sofisticati che negli eucarioti) - I BATTERI MANCANO DI ADEGUATI SISTEMI DI MODIFICAZIONE POSTTRADUZIONALE (glicosilazione, tagli proteolitici, fosforilazione, aggiunta di lipidi). IMPORTANTI CONSEGUENZE SULLA ATTIVITA’ BIOLOGICA E SULLA ANTIGENICITA’

Altri bioreattori per ottenere proteine da usare come antigene: cellule di insetto

…piante

Eat the bioreactor

Extract from the plant

Che cosa è necessario

Protocolli sperimentali disponibili per produrre un vaccino Far crescere i virus in uova embrionate

infezione

Frammentazione, inattivazione, purificazione

Far crescere i virus in colture cellulari

cellula Infezione Frammentazione, inattivazione, purificazione

espressione transiente della sola proteina antigenica

Virus

Espressione transiente in sistemi specifici

Vettore + cellula

Purificazione di proteine intracellulari o secrete

Protocolli sperimentali disponibili per produrre un vaccino

• Crescere i virus in uova embrionate – Inattivarli chimicamente – Frammentarli mediante detergente – Purificare i vari componenti (HA)

• Crescere i virus in colture cellulari – Inattivarli e processarli come sopra

• Crescere virus attenuati o la sola proteina antigenica in uova – Purificarli e produrli per la somministrazione

Il processo basato su uova embrionate, sebbene molto usato presenta delle limitazioni Sono necessari circa 6 mesi per avere le uova

No polli

• • •

Tempo di produzione 6 mesi

1x

No uova

~ 1x

No vaccino

Sono necessari circa 6 mesi dal’ordine alla consegna delle uova ~ 1 uovo è richiesto per una dose di vaccino Una grave limitazione è che le uova possono non essere disponibili (influenza aviaria)

Colture cellulari: un’alternativa alla produzione in uova

Non ci sono problemi di non disponibilità Adatte per una produzione industriale come quella dei vaccini

• I virus dell’influenza sono Ortomixovirus - Types A and B – con un envelope che contiene proteine di superficie quali emoagglutinina (HA), Neuraminadasi (NA) and M2 (NB) – HA e NA sono antigeni e vanno incontro a mutazione e riassortimento – – L’efficacia dei vaccini è valutata principalmente dall’abilità di stimolare anticorpi contro HA

• Vaccini disponibili – Con virus vivi attenuati (piccola percentuale) – Con virus inattivati e alcuni formulati con adiuvante.

Illustrazione schematica delle maggiori attività durante una tipica campagna vaccinica contro l’influenza Jan Jul

Maggiori attività Sorveglianza Selezione del ceppo Preparazione dell’antigene Potenziamento preparazione antigenica Produzione del vaccino Uscita del vaccino Distribuzione del vaccino Somministrazione del vaccino

Feb Mar Apr May Jun Aug Sep Oct

Jul Aug Sep

Nov Dec Jan Feb

Oct

Nov Dec*

Mar Apr May Jun**

Vaccini contro l’influenza a base di HA • Vaccini costituiti dalla proteina HA – – – – –

proteina prodotta in cellule di insetto proteina prodotta in cellule di mammifero proteina prodotta in cellule vegetali Proteina prodotta in lieviti Sequenze della proteina (peptidi) sintetizzate chimicamente

• Vaccini costituiti da: – DNA nudo codificante HA – Inserimento del gene HA in un vettore virale – Batteri intestinali esprimenti HA