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Bases moleculares de la señalización de NF-κB Palabras clave TNF, receptor tipo Toll, IKK, TRAF, ubiquitina, NEMO Resumen Los factores de transcripción de la familia NF-κB (factor nuclear kappa B) son reguladores maestros de los procesos inmunitarios e inflamatorios en respuesta a lesiones e infecciones. En el estado latente, los NF-κB son secuestrados en el citosol por sus proteínas inhibidoras IκB (inhibidor de NFκB). Tras la estimulación de receptores inmunes innatos, como los receptores tipo Toll y los receptores de citoquinas, como los de la superfamilia de receptores de TNF (factor de necrosis tumoral), una serie de eventos proximales a la membrana conducen a la activación de la IKK (IκB quinasa). La fosforilación de IκBs resulta en su degradación proteasomal y la liberación de NF-κB para la translocación nuclear y la activación de la transcripción de genes. Aquí, revisamos la gran cantidad de estudios estructurales en estas vías de activación de NF-κB, incluidas las proteínas TRAF (factor asociado al receptor de TNF), IKK, NF-κB, ubiquitina ligasas y enzimas deubiquitinación. Aunque estas estructuras solo proporcionan instantáneas de procesos aislados, una imagen emergente es que estas cascadas de señalización se unen en grandes complejos de señalización oligoméricos, o señalosomas, para la propagación de la señal. INTRODUCCIÓN Han pasado más de 25 años desde que David Baltimore descubrió el primer miembro de la familia de proteínas nuclear factorkappa B (NF-κB) que se unía selectivamente al potenciador de la cadena ligera κ en extractos de tumores de células B (41, 43, 102) . Desde entonces, los científicos han iluminado el papel de las proteínas NF-κB en la orquestación de procesos biológicos complejos en miles de publicaciones. La familia de factores de transcripción NF-κB eucarióticos regula la expresión de una gran variedad de genes que participan en una serie de procesos como las respuestas inflamatorias e inmunes de la célula, el crecimiento y el desarrollo celular. Los factores de transcripción NF-κB se activan como respuesta a una variedad de señales, que incluyen citoquinas, patógenos, lesiones y otras condiciones estresantes. La activación de las proteínas NF-κB está estrechamente regulada, y la activación inadecuada de las vías de señalización de NF κB se ha relacionado con la autoinmunidad, la inflamación crónica y varios tipos de cáncer (4, 14, 111). En las células no estimuladas, NF-κB se une a una proteína inhibidora, IκB. La unión a IκB enmascara la señal de localización nuclear (NLS) de NF-κB, secuestra el complejo NF-κB · IκB en el citoplasma, y evita que NF-κB se una al ADN. La activación de la señalización de NF-κB es iniciada por estímulos extracelulares. Estos estímulos son reconocidos por los receptores y se transmiten a la célula, donde las proteínas de señalización del adaptador inician una cascada de señalización. Estas cascadas de señalización culminan en la activación de la quinasa IκB (IKK). IKK fosforila la subunidad inhibitoria IκB del complejo NF κB · IκB en el citoplasma. Esta fosforilación marca la degradación del proteasoma por IκB y libera NF-κB del complejo inhibitorio (26, 41, 43, 74, 102). Las proteínas NF-κB liberadas se transportan luego al núcleo donde se unen a sus secuencias objetivo y activan la transcripción del gen. En esta revisión, nos centramos en los mecanismos moleculares de la señalización de NF-κB desde la estimulación del receptor hasta la activación de la transcripción de genes (Figura 1).

Figura 1 Vista simplificada de las vías TLR / IL-1R (izquierda) y TNFR (derecha) que conducen a la activación de NF-κB. Las interacciones conocidas entre proteínas están indicadas y discutidas en detalle en el texto. Abreviaturas: IL-1R, receptor de interleucina 1; NF-κB, factor nuclear κB; TLR, receptor tipo Toll; TNFR, receptor del factor de necrosis tumoral; p, fosforilación. FAMILIA NF-κB Todos los miembros de la familia de proteínas NF-κB, RelA (p65), RelB, c-Rel, p50 (precursor de p105), p52 (precursor de p100) y Relish, comparten un dominio altamente conservado de enlace y dimerización de ADN denominado región de homología de Rel (RHR) que les permite homo o heterodimerizar (4, 14, 27, 28, 39, 73, 108, 111) (Figura 2a). RelA (p65), RelB y c-Rel contienen un dominio de transactivación C-terminal (TAD) que les permite activar la expresión del gen objetivo. p50 (precursor de p105), p52 (precursor de p100) y Relish contienen un largo dominio que contiene repeticiones de anquirina (ARD) en su Cterminus en lugar del dominio TAD y, por lo tanto, no pueden activar la expresión del gen diana como homodímero.

Figura 2 Estructuras de NF-κB y IκBs. (a) Organizaciones de dominio de miembros representativos. (b) Modelo de relleno de espacio de la estructura cristalina del heterocomplejo p50 / p65 unido al ADN. (c) La misma estructura que se muestra en los diagramas de cinta en dos orientaciones. (d) Modelo de relleno de espacio de la estructura cristalina del heterocomplejo p50 / p65 unido a IκBα. NLS de p65 se muestra en rojo. (e) La misma estructura que se muestra en los diagramas de cinta en dos orientaciones. (f) Superposición de p65 en la forma unida a IκBα (azul) y una forma unida al ADN (naranja). Abreviaturas: CTD, dominio terminal C; IκB, inhibidor de NF κB; NF-κB, factor nuclear κB; NLS, señal de localización nuclear; NTD, dominio N-terminal. Estructuras de NF-κB unidos al ADN Las proteínas NF-κB se unen como homo o heterodímero a un par de 10 bases Secuencia de ADN identificada por primera vez en el potenciador del gen de la inmunoglobulina κ-cadena ligera en células B maduras (27, 38, 41, 43, 46, 102, 107) . La primera estructura de un RHR se reveló a partir de la estructura de un homodímero p50 unido a una secuencia de ADN diana κB idealizada (4, 14, 25, 80, 111). Hasta la fecha, varias otras estructuras de dímeros de NF-κB unidas al ADN se han resuelto y revelan un modo común de unión y dimerización del ADN. Las estructuras se asemejan a una mariposa con el dímero proteico que forma las alas alrededor de un cuerpo cilíndrico de ADN (25, 26, 54, 74, 80) (Figura 2b). El dominio RHR de la subunidad NF-κB se forma en dos dominios distintos conectados por un enlazador, el dominio N-terminal (NTD) y el dominio C-terminal (CTD) (Figura 2c). NF-κB usa ambos dominios RHR para rodear el ADN objetivo. La región flexible en el extremo Cterminal del RHR contiene el NLS. El núcleo del NTDandCTD se pliega en una estructura de sándwich β. El CTD es el único responsable de la dimerización y hace contactos de fosfato con el ADN. Además

de los contactos inespecíficos con el esqueleto de fosfato de azúcar del ADN, la NTD también reconoce la secuencia de ADN objetivo a través de la interacción específica con las bases de ADN. El análisis de las estructuras disponibles ha demostrado la plasticidad en la secuencia diana de los homo y heterodímeros NF-κB. El heterodímero canónico NF-κB p50 · p65 reconoce su secuencia diana mediante la unión de p50 a un medio sitio de 5 "-GGPyN y la unión de p65 a otro sitio de 5" GGPyN centrado alrededor de un par de bases A: T. Sin embargo, la flexibilidad en la región enlazadora corta y la arquitectura modular del RHR permiten que NF-κB reconozca las variaciones en las secuencias de ADN κB reposicionando el RHR-NTD en el ADN e interactuando con el esqueleto del ADN. NF-κB unido a IκB inhibidor Las proteínas de la familia κB inhibitoria (IκB) sirven como inhibidores y reguladores de la actividad NF-κB. Los miembros de la familia IκB son las proteínas IκB clásicas (IκBα, IκBβ y IkBε), las proteínas precursoras NF-κB (p100 y p105), y las IκBs nucleares (IκBζ, Bcl-3, y IκBNS). Las proteínas IκB contienen un dominio receptor de señal N terminal (SRD), un ARD central y una secuencia rica en prolina, glutamato, serina y treonina terminal C (PEST) (Figura 2a). IκBα se descubrió por primera vez como un factor que disocia los complejos de NF-κB · ADN preformados in vitro (1, 23, 27, 28, 39, 73, 108, 132). La transcripción de IκBα demostró estar regulada por NF-κB; por lo tanto, IκB a su vez regula la activación e inactivación de NF-κB. Todos los IκBs reconocen NF-κB a través de su ARD. La subfamilia IκB clásica tiene una preferencia por los dímeros NF-κB que contienen una subunidad p65 o c-Rel, mientras que los IκB nucleares prefieren el homodímero p50 o p52 (40, 85). Las estructuras de NF-κB unidas a IκB han revelado un mecanismo común de interacción (41, 43, 74). El dímero NF-κB está unido por una molécula de IκB (Figura 2d). La estructura de IκB ARD contiene seis repeticiones de anquirina, cada una de las cuales consta de un bucle β y dos hélices α. IκB se pliega en una estructura alargada, en forma de barril, con una superficie cóncava y convexa (Figura 2e). La superficie cóncava de IκB se enfrenta a los dominios de dimerización NF κB. En la estructura del complejo heterodímero NF-κB unido a IκB, p50 · p65 · IκBα, las repeticiones de anquirina 1 y 2 se unen a la NLS de p65; las repeticiones 4 y 6 contactan a la p50 en la interfaz de los dominios de dimerización emparejados; y las repeticiones 5 y 6 contactan con el dominio de dimerización de p65 (41, 43). En presencia de IκB, la subunidad p65 del heterodímero NF-κB experimenta un cambio conformacional y adopta una conformación cerrada cuando se compara con el heterodímero unido al ADN (Figura 2f). El NTD de p65 gira ∼180◦ alrededor de su eje largo y se desplaza en ∼38 ˚A hacia su dominio de dimerización. Esto permite la inhibición alostérica de la unión a ADN de NF-κB. Además, IκB contacta directamente los residuos de unión a ADN de NF-κB; la repetición de anquirina 6 y los residuos PEST C-terminales de IκB interactúan con el RHR-NTD e interfieren con la unión del ADN. UBIQUITINACIÓN La ubiquitina es una proteína pequeña que se puede unir a las proteínas objetivo en un proceso postraduccional. Durante la ubiquitinación, el extremo carboxilo terminal de la ubiquitina se une covalentemente a una lisina en la proteína diana. Este proceso requiere varias enzimas: una enzima activadora de ubiquitina E1, una enzima conjugadora de ubiquitina E2 y una ligasa de ubiquitina E3. Después de la adición de la primera ubiquitina a una proteína diana, otras moléculas de ubiquitina pueden unirse a la primera, generando cadenas de poliubiquitina. La ubiquitina contiene siete residuos de lisina, que pueden servir como puntos de unión para moléculas de ubiquitina adicionales. Las cadenas de poliubiquitina clásicas son las cadenas unidas a Lys48, Ub1 (Lys48) Ub2 (Met1), que se dirigen a las proteínas para la degradación por el proteasoma (Figura 3a). Las cadenas de poliubiquitina unidas a Lys63 no son destructivas y, a menudo, se forman en la señalización que desencadena la activación de NF-κB. En estas cadenas, la Lys63 de ubiquitina se usa para unirse a la siguiente molécula de ubiquitina, Ub1 (Lys63) -Ub2 (Met1) (Figura 3b). Esto da como resultado una conformación diferente de los restos de ubiquitina entre sí. Además, se puede usar el término de ubiquitina como un punto de unión, Ub1 (Gly76) Ub2 (Met1) (Figura 3c). Esto da como resultado la formación de un enlace peptídico canónico entre las moléculas de ubiquitina y se denomina una

cadena de ubiquitina lineal. Las cadenas de poliubiquitina lineal y unida a Lys63 son muy similares en su estructura general y difieren principalmente con respecto a sus enlaces isopeptídicos. En contraste con p50 · p65 · IκBα, la estructura del homodímero NF-κB p65 unido a IκBβ reveló que la región que contiene NLS permanece en gran medida flexible y que la NTD de la RHR p65 no contacta con IκBβ (27, 74). Como resultado, los elementos cruciales de unión al ADN parecen estar libres para unirse al ADN incluso en presencia de IκBβ. Estas observaciones están respaldadas por la distribución subcelular de estos dos complejos. Mientras que el complejo p50 · p65 · IκBα se localiza exclusivamente en el citoplasma en las células en reposo (27, 38, 39, 46, 73, 102, 107, 108), el complejo p65 · p65 · IκBβ se transporta entre el citoplasma y el núcleo (25, 27, 38, 46, 54, 80, 107). Aunque los IκB clásicos son bien conocidos, apenas estamos empezando a arrojar luz sobre el mecanismo molecular de los IκB no clásicos IκBζ, Bcl-3 e IκBNS. IκBζ se identificó por primera vez como un gen inducido en células inmunes en respuesta a LPS bacteriana o IL-1 (1, 23, 54, 132), e IκBNS se expresa durante la selección negativa en células T (23, 40, 85). Bcl-3 es un protooncogén y a menudo se encuentra que se transloca en las leucemias de células B (78, 85). Los IκBs nucleares se concentran en el núcleo cuando se expresan en células (31, 78) y se unen específicamente a los homodímeros p50 de NF-κB (16, 31, 77, 96, 119, 133). EL COMPLEJO IKK Un paso clave en la vía de señalización de NF-κB es la regulación de la interacción entre NF-κB y el inhibidor de IκB. La mayoría de las vías de señalización que conducen a la activación de NF-κB convergen en un complejo de 700–900-kDa que contiene una quinasa IκB específica de serina, denominada complejo IKK (16, 77, 96, 119, 133). El complejo IKK consta de dos subunidades catalíticas, IKKα e IKKβ, asociadas como homo (α · α o β · β) o heterodímero (α · β) unidas estequiométricamente a una subunidad reguladora, NEMO (IKKγ) (50). El complejo IKK es funcionalmente pleiotrópico y desempeña un papel importante en muchos procesos biológicos, que incluyen inflamación, autofagia, señalización de insulina y respuesta al daño del ADN. El complejo es responsable de la fosforilación de dos residuos de serina en el SRD de IκB (76, 77, 97, 124, 133). La fosforilación de IκB a su vez conduce a la poliubiquitinación unida a Lys48 (Figura 3) (ver barra lateral, Ubiquitinación), que se dirige a IκB para la degradación por el proteasoma. La degradación proteosómica de IκB finalmente libera y activa NF-κB.

figura 3 Resumen estructural de (a) Lys48 enlazado, (b) Lys63 enlazado y (c) di-ubiquitina lineal (di-Ub) que muestra la conformación general diferente resultante. Lys48, Lys63 y Met1 se resaltan en rojo. Tenga en cuenta que en las cadenas lineales di-ub, no se utiliza ningún residuo de lisina para el enlazador.

Estructura de la subunidad catalítica del complejo IKK Las subunidades catalíticas IKKα e IKKβ comparten un 50% de identidad de secuencia. La estructura de IKKβ reveló una arquitectura dimérica que contiene un dominio quinasa N-terminal, seguido de un dominio similar a la ubiquitina (ULD) y un dominio de andamio / dimerización (SDD), que se asemeja a la forma de un par de tijeras (122) (Figura 4a, segundo). Los dominios de quinasa y ULD forman el "mango" de las tijeras y la "hoja" está formada por el SDD. Los tres dominios interactúan mutuamente entre sí. El extremo C-terminal contiene el dominio de enlace NEMO (Figura 4a). El ULD se requiere para la actividad catalítica de IKKβ y, junto con el SDD, ayuda a unir, posicionar y orientar IκBα con respecto a la bolsa catalítica IKKβ. La dimerización de IKKβ está mediada por el dominio SDD, y se ha demostrado que IKKβ de longitud completa es un dímero en la solución (122). Sin embargo, en el dímero IKKβ, los dominios de quinasa no están localizados cerca uno del otro y son incapaces de promover la trans-autofosforilación trans intradímera. Esto sugiere un papel para una mayor oligomerización en la activación de IKKβ. De hecho, IKKβ existe como un dímero de dímeros en la estructura cristalina observada. En esta conformación, los bucles de activación de los dominios de quinasa están en una posición lo suficientemente cerca para activar la quinasa del dímero vecino (26, 74, 122). Esta conformación puede ser transitoria y estabilizada por los socios de interacción como NEMO y la red de cadenas de ubiquitina. La subunidad reguladora NEMO del complejo IKK es principalmente helicoidal y contiene los dominios helicoidales denominados HLX1, CC1, HLX2 y CC2, seguidos de un dominio de cremallera de leucina y una región de dedos de zinc (ZF) C-terminal (27, 28, 39, 73, 76, 97, 98, 108, 124). El dominio de unión a quinasa (KBD) contiene HLX1 y parte de CC1. No hay una estructura completa de NEMO; sin embargo, varias estructuras que contienen dominios individuales han sido resueltas y permiten una vista de un modelo NEMO de bobina flexible (CC) alargado y flexible (Figura 4c-g).

Figura 4 Estructuras del complejo IKK. (a) Organizaciones de dominio. (b) Estructura cristalina de IKKβdimer. (c) Estructura cristalina de IKKβNBD en complejo con el dominio de unión a quinasa N-terminal (HLX1) de NEMO. (d) Estructura cristalina de NEMO HLX2 en complejo con vFLIP. (e) Estructura cristalina de CC2-LZ de NEMO en complejo con di-Ub lineal. (f) Estructura del dominio NEMO ZF. (g) Un modelo de dímero NEMO de longitud completa. Abreviaturas: di-ub, di-ubiquitina; IKK, IκB quinasa; NBD, dominio de unión a NEMO; NEMO, NF-κB modulador esencial; ZF, dedo de zinc. El dominio de unión a IKKβ: Reconocimiento de IKKβ por NEMO La estructura cristalina de la KBD en complejo con la región Cterminal de IKKβ revela un heterotetramer en el que las moléculas se empaquetan como un haz paralelo de cuatro hélices (33, 60, 98, 105, 127) (Figura 4c ). Las dos moléculas de NEMO ensamblan un dímero de cabeza a cabeza con cada molécula formando una hélice α en forma de media luna que interactúa con la otra molécula de NEMO en los extremos N y C. El dímero NEMO se estabiliza por interacciones hidrófobas en los extremos N y C, pero deja una abertura en forma de hendidura entre ellos. El parche de dimerización N-terminal es más extenso y está reforzado por interacciones electrostáticas adicionales. Las dos moléculas IKKβ no se contactan entre sí, sino que se asocian con cada una de las moléculas de NEMO, respectivamente. Aunque la interacción entre la molécula NEMO y la IKKβ no es extensa en el término Nervio, las moléculas de IKKβ se encajan estrechamente en el dímero NEMO en el extremo C-terminal. El bolsillo de unión a IKKβ de NEMO interactúa principalmente con tres grandes cadenas laterales hidrófobas de IKKβ que están orientadas hacia el bolsillo de unión en NEMO. Esto da como resultado una interacción específica de alta afinidad entre NEMO y IKKβ. NEMO y vFlip Durante la batalla constante entre nuestro sistema inmunológico y los patógenos, los patógenos invasores han aprendido a manipular los procesos celulares en su beneficio. Se ha observado que los virus linfogénicos, por ejemplo, aumentan la supervivencia celular y la proliferación al activar NF-κB (22, 29, 33, 44, 52, 60, 105, 127). Las proteínas FLIP son un grupo de proteínas celulares identificadas como inhibidores de la apoptosis inducida por el receptor de la muerte (42, 110). Las proteínas FLIP virales (vFLIP) son proteínas codificadas de forma viral que se utilizan para manipular las células huésped (11). En el caso del virus del sarcoma de Kaposi, KSHV, el vFLIP se produce en las células infectadas y se ha demostrado que interactúa con el complejo IKK y lo activa (2, 22, 29, 41-44, 102). Se ha resuelto la estructura cristalina de theKSHVvFLIP en complejo con su región objetivo en NEMO (2, 4, 14, 111). La estructura revela dos moléculas de vFLIP unidas a la mitad C terminal del dímero de cabeza a cabeza de la región NEMO HLX2 (Figura 4d). Los monómeros vFLIP se unen a NEMO de manera esencialmente idéntica. Están orientados cara a cara pero no interactúan entre sí. vFLIP consta de dos dominios de efectos de muerte, DED1 y DED2, de los cuales DED1 es el principal contribuyente a la extensa interfaz compleja. La interfaz muestra un alto grado de complementariedad estructural y se caracteriza por dos fisuras verticales en la superficie de vFLIP. Cada una de las hendiduras interactúa con una molécula del dímero NEMO. Sin embargo, una de las hendiduras, la hendidura 1, es más extensa y comprende un bolsillo asimétrico. El compartimento superior de este bolsillo es profundo e hidrofóbico, mientras que la parte inferior de la hendidura es más abierta y media las interacciones hidrofílicas. Curiosamente, la temática NEMOL227P se encuentra en pacientes con el trastorno genético crónico displasia ectodérmica anhidrótica con inmunodeficiencia y se localiza en la región HLX2 de NEMO (2, 14, 26, 41, 43, 74, 102). La mutación L227P por lo tanto puede cambiar la tendencia de plegamiento helicoidal de NEMO y desestabilizar el dímero NEMO en la célula (2, 4, 14, 18, 27, 28, 39, 73, 108, 111, 120). Se asume que la estabilización de la dimerización de NEMO, ya sea por señalización del receptor o por intervención viral, activa NEMO. Por lo tanto, la estabilización o desestabilización de NEMO puede ser un punto importante de regulación en la vía de señalización de NF κB.

NEMO y Di-Ubiquitin Aunque NEMO no tiene una actividad catalítica, es esencial para la ruta NF-κB. NEMO puede reconocer específicamente las cadenas de poliubiquitina lineales y ligadas a Lys63 (Figura 3). Muchas de las proteínas en la cascada de señalización de NF-κB, incluyendo el propio NEMO y TRAF6, están poliubiquitinadas. La unión de NEMO a la poliubiquitina es crucial para el reclutamiento de IKK y la posterior activación de NF-κB (12, 13, 18, 27, 38, 41, 43, 46, 68, 102, 107, 120, 131). Se postuló que las cadenas de poliubiquitina sirven como un andamio extendido para el reclutamiento de moléculas de señalización y aumentan la oligomerización más alta (21). El análisis de la estructura secundaria y varias estructuras de rayos X mostraron que, con la excepción del ZF del terminal carboxi, el NEMO es esencialmente una proteína α-helicoidal alargada. Mientras que la región Nterminal interactúa con las subunidades IKK catalíticas, la región C-terminal es responsable de la unión de la cadena de ubiquitina (122). Se han determinado las estructuras cristalinas de la región NEMO CC2-LZ sola y en complejo con diubiquitina (di Ub) lineal o ligada a Lys63 (4, 12–14, 25, 68, 80, 111, 131). El NEMO forma un dímero de cabeza a cabeza que abarca ∼110 A˚ (Figura 4e). El dímero observa una simetría pseudo-doble, y cada molécula del dímero NEMO forma una hélice continua (25, 26, 54, 68, 74, 80). A diferencia de las proteínas CC clásicas, las dos moléculas de NEMO usan residuos hidrófobos y porciones alifáticas de residuos cargados para empacar entre sí. El dímero CC2-LZ de NEMO proporciona una superficie de unión compuesta con contribuciones de ambas moléculas de NEMO para la ubiquitina. NEMO CC2 LZ se une preferentemente di-Ub lineal y tiene una afinidad moderada hacia di-Ub unida a Lys63. Se encontró que di-Ub ligado a Lys48 no se une al NEMO CC2 LZ. En la unión di-ub lineal, NEMO se une a un parche superficial hidrófobo conservado y la cola C-terminal de la ubiquitina distal mientras reconoce una superficie adyacente en la ubiquitina proximal (1, 23, 27, 28, 39, 68, 68, 73, 108 , 131, 132). En el caso de la unión di-Ub unida a Lys63, solo una ubiquitina entra en contacto con cada dímero NEMO, lo que explica la afinidad más baja observada (5, 40, 85, 131). Por lo tanto, aunque las cadenas de ubiquitina lineal y unida a Lys63 comparten una arquitectura estructural abierta y extendida (56), las diferencias sutiles en los enlaces y las conformaciones subyacen a sus funciones distintas en la activación de NF-κB. NEMO ZF El extremo C-terminal de NEMO contiene una ZF que se ha demostrado que se une a la ubiquitina. Las mutaciones en la ZF se han relacionado con la displasia ectodérmica anhidrótica humana con inmunodeficiencia e incontinencia pigmentaria (24, 41, 43, 74). Los estudios de resonancia magnética nuclear revelaron que el NEMOZF se pliega en un pliegue β-β-α canónico (Figura 4f). Curiosamente, un mutante que falta el último residuo quelante de zinc (C417F) retiene la capacidad de unirse al zinc con una afinidad de tipo nativo (13, 41, 43). Sin embargo, el análisis de la superficie de ZF y los experimentos bioquímicos identifican dos sitios de interacción de proteínas putativos que se desestabilizan en el mutante y pueden explicar los defectos de señalización del mutante C417F. Además, se demostró que el NEMOZF es un dominio de unión a ubiquitina, que se une a la ubiquitina con una estequiometría 1: 1 y afinidad submilimolar (12, 27, 74). La interacción entre el NEMO ZF y la ubiquitina se asemeja a las interacciones resueltas previamente entre los dominios de unión a ubiquitina helicoidal α y la ubiquitina; la α-hélice anfipática del NEMO ZF se une a un parche hidrófobo centrado alrededor del residuo Ile44 de la ubiquitina (12, 27, 38, 39, 46, 73, 102, 107, 108). SEÑALIZACIÓN A TRAVÉS DEL RECEPTOR DE TNF SUPERFAMILIAR En la vía canónica de NF-κB, las señales proinflamatorias como las citoquinas, los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y los patrones moleculares asociados con el peligro activan una cascada de señalización que conduce a la activación de IKK, que finalmente libera a NFκB de su complejo inhibitorio. Se han dilucidado varias vías de activación inducidas por el receptor de IKK para la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) y la superfamilia del receptor tipo Toll / interleuquina-1 (TLR / IL-1R).

Las cascadas de señalización desencadenadas por la superfamilia TNFR son diversas y pueden inducir la ruta NF-κ o la apoptosis (3, 5, 25, 27, 38, 46, 54, 80, 107). El resultado de la señalización está determinado por las proteínas reclutadas Dominio intracelular de las TNFRs. Tras la trimerización dependiente de ligando de la TNFR, los factores asociados a la TNFR (TRAF) se reclutan en el receptor directamente oa través de proteínas adaptadoras (1, 3, 23, 54, 75, 92, 132). Por ejemplo, después de la unión de TNF-α, TNFR1 recluta la proteína adaptadora TRADD a través de la interacción del dominio de la muerte (DD), que a su vez recluta TRAF2 (Figura 1). Las proteínas TRAF contienen un dominio RING N-terminal, seguido de varias ZF y un CTD que contiene aCC y la regiónTRAF-C (5, 23, 34, 35, 40, 75, 85, 92) (Figura 5a). La parte C-terminal de las TRAF facilita la trimerización y participa en interacciones específicas de secuencia con el receptor de TNF y las proteínas adaptadoras. La región N-terminal de la dimerización de TRAFsmediates y en el caso de TRAF6, funciona como una ubiquitina ligasa (E3) para la poliubiquitinación unida a Lys63 (5, 34, 35, 70, 78, 85, 115, 115, 134). La diferencia en la simetría de la región N-terminal y la región Cterminal probablemente da como resultado una dimerización y trimerización alternas, lo que lleva a una agregación infinita de TRAF (129). La formación de conjuntos de alto orden es necesaria para la poliubiquitinación mediada por TRAF6 y la activación de NF-κB (129). La región CC del trímero TRAF2 recluta cIAP1 / 2 (5, 7, 31, 34, 35, 70, 78, 115, 134), y los dominios RING de la poliubiquitinación nucleada cIAP1 / 2 de proteínas diana, incluida la quinasa RIP1, NIK , TRAF2 y cIAP1 / 2 (5, 7, 16, 30, 31, 34, 35, 69, 77, 95, 96, 119, 133). El RIP1 biquitinado sirve como plataforma para el ensamblaje de proteínas posteriores como la transformación del crecimiento. factor (TGF) -β activada quinasa 1 (TAK1), proteína de unión a TAK1 (TAB) 2 y TAB3, y NEMO, así como otras ligasas de ubiquitina como el complejo de ensamblaje de cadena de ubiquitina lineal (7, 16, 30, 69). , 77, 95, 96, 119, 129, 133). La unión de NEMO a las cadenas de ubiquitina promueve la activación de IKK, ya sea por inducción de cambios conformacionales o colocando IKK en un contexto en el que es susceptible a la fosforilación por quinasas corriente arriba como TAK1 o autofosforilación trans. La ubiquitinación de NIK por cIAP1 / 2 conduce a su degradación proteasomal y la supresión de la vía no canónica NF-κB. Estructura de TRAF RING-ZF e interacción con Ubc13 TRAF6 es una ubiquitina ligasa E3 crucial para la activación de NF-κB inducida por TNFR, TLR e IL1R y las vías de señalización AP-1 (50, 121). Se demostró que la dimerización de TRAF6 es crucial para la actividad de la ligasa E3 in vitro y la activación de NF-κB in vivo (76, 77, 97, 124, 129, 133). Los mutantes de TRAF6 incapaces de formar dímeros están comprometidos en el ensamblaje de la cadena de poliubiquitina y la promoción de la fosforilación de IκB (122, 129). Las estructuras de la región N-terminal de TRAF2 y TRAF6 contienen el dominio RING y parte de la región ZF y han revelado que ambas proteínas forman homodímeros (122, 128, 129) (Figura 5b, c). La homodimerización está mediada por el dominio RING y la región enlazadora adyacente y se ha confirmado en la solución (122, 128, 129). La estructura de TRAF6 se puede describir como una formación similar a un palo de golf con las ZF que forman el eje y el dominio RING que forma la cabeza del palo (76, 97, 98, 124, 128, 129). El dominio RING se pliega en un pliegue cruzado canónico, pero contiene un Asp en lugar de un residuo de coordinación de zinc más clásico. La interfaz del dímero hidrófobo está formada por cadenas laterales apiladas aromáticas y alifáticas, que se conservan entre las proteínas TRAF. Los tres ZF forman el pliegue β-β-α canónico y exhiben orientaciones conservadas entre sí. Se demostró que la región N-terminal de TRAF6 funciona como una ubiquitina ligasa E3 (33, 60, 98, 105, 121, 127). La estructura compleja entre TRAF6 y su E2 Ubc13 se asemeja a otras estructuras RING · E2. El núcleo del complejo está formado por interacciones hidrófobas del dominio RING cerca del primer sitio de unión a zinc, mientras que los residuos N-terminales al dominio RING forman interacciones cargadas adicionales (Figura 5d). El primer ZF de la región es necesario para la interacción de TRAF6 con Ubc13, aunque ZF no contacta directamente con Ubc13. La ZF1 forma una

lámina β antiparalela trenzada con residuos N-terminal al dominio RING, bloqueando así estos residuos en una conformación adecuada para la unión de Ubc13. Interesantemente, la superposición de la estructura de TRAF2RING theTRAF6 · Ubc13 revela enfrentamientos estéricos entre TRAF2 y Ubc13 (22, 29, 33, 44, 52, 60, 63, 75, 81, 92, 105, 126–128), y la TRAF2 purificada falla interactuar con UBC13 en ensayos de cambio de gel in vitro (128). Los residuos críticos para la unión de Ubc13 en TRAF6 no se conservan en TRAF2, y las mutaciones de estos residuos en sus contrapartes de TRAF2 anulan la interacción Ubc13, así como la actividad E3 de TRAF6. Por lo tanto, TRAF2 requiere interacción con cIAP para inducir la poliubiquitinación (115, 134). TRAF CC Dominio e Interacción con cIAP TRAF2 y cIAP forman un complejo E3 y son componentes esenciales de las vías NF-κB canónicas y no canónicas inducidas por TNF-α. (70, 71, 115,134) .Con enlace al TNF α, TNFR1 recluta la proteína adaptadora TRADD, que a su vez recluta TRAF2 y RIP1. La poliubiquitinación de RIP1 unida a Lys63 es esencial para la activación de IKK (18) y depende de la unión de TRAF2 a cIAP1 / 2 (115, 134). El dominio TRAF2-CC forma un homotrímero continuo solo y en complejo con el dominio BIR1 de cIAP2 (70, 134) (Figura 5e). Sorprendentemente, cada trímero TRAF-CC interactúa con una sola molécula de cIAP tanto en la estructura cristalina como en la solución. Tras la unión de cIAP, el trímero TRAF2-CC experimenta cambios conformacionales sutiles, que dan como resultado un sitio de unión mejorado al mismo tiempo que prohíbe la unión de otras moléculas de cIAP a los otros dos sitios de unión potenciales en el trímero TRAF-CC. A diferencia de TRAF2, el papel de TRAF1 en la activación de NF-κB aún no está claro. Se ha sugerido que TRAF1 actúe como un regulador tanto negativo como positivo, posiblemente de una manera dependiente del tipo de célula. Poco se sabe sobre el mecanismo exacto de regulación. Sin embargo, en presencia de TRAF1-CC, se forma preferentemente un heterotrímero que consiste en una molécula de TRAF1-CC y dos moléculas de TRAF2-CC (TRAF1 · [TRAF2] 2) (134). Curiosamente, el análisis bioquímico de esta interacción mostró que el heterotrímero TRAF1 · [TRAF2] 2 tiene una afinidad más alta por el cIAP2 que el homotrímero TRAF2. La inspección del homotrímero TRAF2 CC y las estructuras del heterotrímero TRAF1 · [TRAF2] 2 revela un alto grado de similitud. Sin embargo, tras la superposición de las moléculas de cIAP2, se observa una rotación relativa de ∼9◦ entre los dos trímeros. Además, la interacción con cIAP2 está mediada principalmente por TRAF1 y muestra una mayor hidrofobicidad y una mejor complementariedad de formas que la observada en el homotrímero. Se demostró que TRAF1 rescata a un mutante defectuoso en la unión de cIAP2 de TRAF2 y fue capaz de inhibir la degradación proteosomal inducida por TNFR2 de TRAF2 (17, 134). Por lo tanto, las diferencias en la afinidad de unión y el modo de cIAP a TRAF1 · [TRAF2] 2 y TRAF2 trímero proporcionan una primera explicación para estas funciones reguladoras de TRAF1 en la activación de NF-κB.

Figura 5 Estructuras de los TRAFs. (a) Organizaciones de dominio. (b) Estructura cristalina de los dominios RING y ZF diméricos (ZF1–3) de TRAF6. (c) Estructura cristalina del dominio DING y ZF dimérico (ZF1) de TRAF2. (d) Estructura cristalina de TRAF6 RING y dominio ZF (ZF1) en complejo con Ubc13. (e) Estructura cristalina de TRAF2 CC en complejo con el dominio cIAP2 BIR1. (f, g) Estructura cristalina del dominio TRAF de TRAF2 en complejo con un péptido del receptor CD40 en diagramas de relleno de espacio y de cinta, respectivamente. (h, i) Estructura cristalina del dominio TRAF de TRAF2 en complejo con el NTD de TRADD en diagramas de relleno de espacio y de cinta, respectivamente. (j) Un modelo de agregación infinita de proteínas TRAF de longitud completa mediante alternancia de dimerización y trimerización. Abreviaturas: CC, bobina enrollada; NTD, dominio N-terminal; TRAF, factor asociado con el receptor del factor de necrosis tumoral (TNF). TRAF CTD e interacciones con péptidos y TRADD El TNFR activado recluta adaptadores de señalización a sus dominios intracelulares. La superfamilia TNFR se puede dividir en dos subgrupos: los TNFR denominados receptores de la muerte que contienen un DD intracelular y los TNFR sin un DD. Aquellos sin un DD pueden reclutar directamente a miembros de la familia TRAF. Los receptores de muerte relacionados con TNFR1 requieren la proteína adaptadora TRADD para reclutar TRAF2. TheDDof TRADD se une al receptor, y el NTDof TRADD facilita la interacción con TRAF2 (92, 93).

Se han resuelto varios complejos entre los péptidos receptores y TRAF2 (63, 75, 81, 92, 126). En general, estos complejos se asemejan a una forma similar a una seta con el dominio TRAF2-CC como el tallo y el dominio de sándwich β como la tapa de la seta (Figura 5f, g). En todas las estructuras del receptor · TRAF2, los péptidos del receptor tienen una conformación de la cadena principal extendida y forman una cadena β. Esta cadena β extiende el sándwich β de TRAF2 en el borde de la tapa de la seta. Los motivos de unión a TRAF2 se definen por interacciones específicas de la cadena lateral entre los péptidos receptores y TRAF2 (75, 92, 126). La estructura cristalina de la CTD (CC y TRAF-C) de TRAF2 y la NTD de TRADD (TRADD-N) revelan que la forma de hongo de TRAD2, similar a la seta, está decorada por tres moléculas de TRADD unidas al lado superior de la tapa de la seta (93) (Figura 5h, i). Cada una de las moléculas de TRADD interactúa exclusivamente con el pliegue en sándwich β de una subunidadTRAF2. TRADD-N se pliega en un sándwich α-β con una hoja β de cuatro cadenas y seis hélices α (Figura 5h, i). La interfaz está dividida en dos regiones. La Región 1 es en gran parte hidrófoba y está formada por una protuberancia de superficie en TRAF2 y una cara superficial expuesta de la lámina β de TRADD. La Región II está formada por una cresta altamente cargada en TRADD y una depresión superficial de TRAF2 y presenta una interfaz hidrofílica con muchos enlaces de hidrógeno y puentes salinos. TheCterminus ofTRADD-Nprojects se aleja del complejo TRADD · TRAF2 e indica una posible ubicación del C-terminalDD de TRADD, que se une directamente al DD intracelularDD de TNFR1 cerca de la membrana celular. El DominioDD de TRADD también es una plataforma central para el reclutamiento de moléculas de señalización intracelular como FADD para la unión de caspasa-8 o RIP1 para la activación de NF-κB. En esta conformación, las regiones CC triméricas sobresalen hacia el centro de la célula, preparadas para interactuar con proteínas de señalización corriente abajo, como los CIAP. Curiosamente, la región de unión de TRAADDonTRAF2 es similar a la región de superficie ocupada por los péptidos receptores (71, 75, 92, 115, 126) y destaca la naturaleza competitiva del reclutamiento directo e indirecto de TRAF por parte de la familia TNFR. TRAF Oligomerización de orden superior Aunque la parte N-terminal de las proteínas TRAF forma dímeros, los CTD forman trímeros. Esta aparente discrepancia de simetría dentro de la misma proteína puede rectificarse con una red de oligomerización de orden superior. De hecho, la agregación espontánea de TRAF6 endógeno se ha observado como una respuesta a la estimulación del receptor in vivo (129). Además, los experimentos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia han demostrado que TRAF6 puede formar oligómeros de orden superior. La capacidad de oligomerizar puede ser abolida por un mutante incapaz de dimerización. Tomando en conjunto toda la información estructural disponible, se propuso un modelo de TRAF6 de longitud completa activada (88, 106, 129) (Figura 5j). El modelo TRAF6 revela el potencial de una oligomerización infinita en una red bidimensional a través de las interfaces de dimerización y trimerización. Esta red de interacciones llevaría a un aumento en la concentración local de todas las proteínas de señalización asociadas al proporcionar una plataforma de acoplamiento y promover la autoubiquitinación, la poliubiquitinación y la señalización en sentido descendente. SEÑALANDO CASCADAS TRIGGADAS POR LA TLR / IL-1R SUPERFAMILIA La superfamilia TLR / IL-1R pertenece a los receptores de reconocimiento de patrones, y cada TLR reconoce un PAMP específico a través de su dominio extracelular. Los PAMP incluyen lipopolisacáridos de bacterias gramnegativas, peptidoglicano y ácido lipoteicoico de bacterias grampositivas, ARN indicativos de la presencia de virus y varias formas de señales de estrés. Los TLR están relacionados con la subfamilia IL-1R de los receptores de membrana. Comparten un dominio Toll / IL-1R (TIR) común y citoplásmico y, en consecuencia, utilizan componentes superpuestos para la señalización en sentido descendente. Los TLR se conservan evolutivamente de Caenorhabditis elegans a mamíferos y, hasta la fecha, se han identificado un total de 13TLRs de

mamíferos. Los TLR están compuestos por tres dominios: una región de repetición extracelular (LRR) extracelular N-terminal que detecta patógenos extracelulares y señales generadas durante lesión tisular, un solo dominio transmembrana y un dominio TIR intracelular C-terminal (88, 106, 112) (Figura 6a). Tras la activación inducida por ligando, los TLR y los IL-1R forman dímeros (62, 112) o alteran su conformación preexistente (45, 49, 62, 67, 90, 130). Interacciones proximales de membrana Hasta la fecha, varias estructuras del dominio extracelular de TLRs unidas a un ligando se han resuelto y revelan una estructura general común (45, 49, 67, 90, 130). Los dominios LRR extracelulares de los TLR diméricos se asemejan a una forma m con los dos extremos N que se extienden en direcciones opuestas y los dos extremos C que convergen en la región media. Sin embargo, cada uno de los diferentes ligandos está unido a distintas superficies en los dímeros de TLR. Los receptores de la familia IL-1R contienen tres dominios similares a inmunoglobulina en su porción extracelular (Figura 6a). Tras la unión inicial a IL-1R1, se requiere asociación con IL-1RAcP para la unión firme de la citoquina y la señalización corriente abajo (57, 87, 102). Las estructuras de IL-1 unido a IL 1R1 · IL-1RAcP y el heterodímero IL-1R1 · IL-1RII revelan una arquitectura similar y muestran que los dominios de tipo Ig del receptor se acercan en la dimerización (26, 109 , 114, 117). Los TLRs y la familia de receptores de membrana IL-1R comparten un dominio TIR citoplásmico común y, en consecuencia, utilizan componentes superpuestos para la señalización descendente (28, 86). Se sugirió que los oligómeros de orden superior de los receptores pueden ser críticos para el inicio de la señal intracelular (79, 102). El dominio TIR forma una pequeña lámina β, globular y paralela, rodeada por hélices α (25, 80, 123) (Figura 6c). Se piensa que tras la unión del ligando al dominio extracelular, los dominios TIR intracelulares están muy próximos entre sí y pueden participar en la interacción homotípica. Esto crea una plataforma desde la cual la oligomerización de moléculas adaptadoras que contienen el dominio TIR puede ser nucleada (1, 88, 106, 132). Hasta la fecha, se han identificado cinco moléculas adaptadoras: gen de respuesta primaria de diferenciación mieloide 88 (MyD88), proteína tipo adaptador MyD88, dominio TIR que contiene IFNβ inductor de proteína adaptadora (TRIF), molécula adaptadora relacionada con TRIF y motivo estéril α y de armadillo -con proteínas que contienen (40, 88). Se conocen varias estructuras de dominios TIR. Sin embargo, debido a la dificultad de reconstituir oligómeros de dominio TIR estables, la naturaleza de la oligomerización del dominio TIR sigue siendo difícil de alcanzar. Y varios modelos propuestos basados en estudios de mutagénesis, estructuras cristalinas o estudios de acoplamiento aún esperan confirmación (41, 43, 51, 74, 83, 84, 113).

Figura 6 Estructuras del Myddosome y otras interacciones proximales a la membrana en la vía TLR / IL-1R. (a) Organizaciones de dominio. (b) Estructura cristalina del complejo DD del Myddosome en dos orientaciones, mostrando una estructura con 6 moléculas MyD88, 4 IRAK4 y 4 IRAK1 o IRAK2. (c) Un modelo estructural de los eventos proximales a la membrana en la señalización TLR. Abreviaturas: DD, dominio de la muerte; IL 1R, receptor de interleucina 1; IRAK, cinasa asociada al receptor de interleucina 1 (IL-1R); MyD88, gen de respuesta primaria de diferenciación mieloide 88; TLR, receptor tipo Toll. Interacciones oligoméricas de DD y activación de IRAK: The Myddosome Se sugirió que los oligómeros de orden superior de los receptores pueden ser críticos para el inicio de la señal intracelular (79, 102). Tras la unión del ligando al receptor, los dominios TIR intracelulares están muy próximos entre sí y pueden participar en la interacción homotípica. Esto crea una plataforma TIR inicial en la que otras moléculas adaptadoras que contienen el dominio TIR pueden ensamblarse y oligomerizarse (88, 106, 132). La principal proteína adaptadora de señalización para la señalización TLR e IL-1R es MyD88. Además de su dominio TIR, contiene un DD C-terminal (Figura 6a). MyD88 es un miembro de la superfamilia DD, que también incluye pirina, reclutamiento de caspasas y dominios de efectos de muerte (91). El pliegue DD contiene seis hélices α antiparalelas dispuestas en un paquete de llaves griegas (37, 104). El pliegue DD se caracteriza por una homología de secuencia baja que genera superficies de interacción diversas y específicas. Dentro de cada subfamilia, los miembros forman interacciones

homotípicas conservadas y facilitan el ensamblaje de complejos de señalización oligoméricos, que son componentes cruciales de las vías de señalización inflamatorias y apoptóticas. En las vías inducidas por TLR e IL-1R, MyD88 se asocia con miembros de la familia de quinasas asociadas a IL-1 (IRAK). Las proteínas IRAK contienen un DD N-terminal seguido de un dominio de cinasa Cterminal (Figura 6a). Los DD de MyD88 y IRAK se ensamblan en un gran complejo oligomérico denominado Myddosome (79). La estructura de este Myddosome ha sido resuelta y revela una forma de torre que consta de cuatro capas; una capa de IRAK4 se intercala entre dos capas superiores de MyD88 y una capa inferior de IRAK2 (66) (Figura 6b). Los DD de MyD88, IRAK4 e IRAK2 se ensamblan en una estructura helicoidal zurda que se estabiliza por tres tipos de interacciones DD conservadas (20). La forma de la superficie y la complementariedad de la carga entre las capas adyacentes y el hecho de que el IRAK4DD es monomérico mientras que el DDofMyD88 es propenso a la oligomerización en solución, sugiere un orden de ensamblaje secuencial de todo el complejo (66). Por lo tanto, un mecanismo de montaje jerárquico estricto se puede imaginar fácilmente. Primero, la unión de un ligando al receptor acerca los dominios TIR del receptor intracelular, lo que lleva al reclutamiento de MyD88. En segundo lugar, el DD de MyD88 oligomeriza y nuclea la unión y oligomerización de IRAK4. En tercer lugar, después de que cuatro moléculas IRAK4 hayan ensamblado una capa de Myddosome, las moléculas IRAK2 e IRAK1 se pueden unir a Myddosome. Se demostró que IRAK4 fosforila el bucle de activación de IRAK1 y se autofosforila a sí mismo in vitro (64), mientras que se encontró que MyD88 promueve la fosforilación de IRAK1 y IRAK4 (9). Esto sugiere que el Myddosome proporciona una plataforma en la que IRAK4 inicia la fosforilación y se propaga en sentido descendente a IRAK1 y IRAK2. IRAK1 fosforilado y IRAK2 a su vez reclutan TRAF6 a la membrana (10, 94, 125) (Figura 6c). Activación del complejo TAK1 El complejo TAK está involucrado en las vías de señalización inducidas por varias citoquinas, incluyendo TGF-β, TNF-α, IL 1 e incluso LPS (61), y se requiere para activar IKK. El complejo TAK consta de una quinasa, TAK1 y TAB1, TAB2 y TAB3 (Figura 7a). TAK1 es un miembro de la familia MAPKKK (82). TAK1 requiere TAB1 para su actividad quinasa (53, 103). La estructura del complejo TAK1 · TAB1 muestra que la α-hélice interactiva de TAB1 está unida en una amplia bolsa en la superficie del lóbulo de la quinasa TAK1 C-terminal (8) (Figura 7b). Esta estrecha interacción promueve la autofosforilación del lóbulo de activación de la quinasa TAK1, probablemente a través de un mecanismo alostérico (8, 89, 100). El complejo TAK1 está regulado por la poliubiquitinación unida a Lys63 (116). Se mostró que los dominios ZF de TAB2 y TAB3 reconocen específicamente las cadenas de poliubiquitina unidas a Lys63 que están sin anclar o ancladas a proteínas de sustrato como RIP1, TRAF6 o NEMO; Las mutaciones que impiden la unión de poliubiquitina anulan la activación del complejo TAK1 o IKK (48, 116). El análisis de la estructura secundaria muestra una estructura de dominio similar para TBA2 y TAB3: un dominio de unión a ubiquitina (CUE) en el extremo N y una región CC, seguido de un dominio de unión a TAK1 (TB) y un CTP terminal Npl4 ZF (NZF) (48). Las secuencias de los dominios NZF TAB2 y TAB3 son aproximadamente el 80% idénticas, y las estructuras cristalinas de ambos en complejo con poliubiquitina unida a Lys63 se han resuelto y son prácticamente idénticas (59, 101). El TNBZ se pliega en un par de láminas antiparalelas de β seguido de un bucle largo y se une a ambos restos de ubiquitina simultáneamente (Figura 7c) .TAB no reconoce el enlace isopeptídico unido a Lys63 pero interactúa con parches hidrófobos centrados alrededor de Ile44 en los restos de ubiquitina adyacentes. La especificidad para la ubiquitina ligada a Lys63 se logra mediante restricciones conformacionales. Los sitios de unión a ubiquitina distal y proximal del TAB NZF están organizados para optimizar la unión simultánea a los restos de ubiquitina adyacentes en una configuración específica para las cadenas de ubiquitina unidas a Lys63 (56). Las restricciones conformacionales impuestas por TAB en el di-Ub enlazado con Lys63 no pueden ser adoptadas por un enlace lineal (59).

Varios dominios NZF de TAB podrían unirse a largas cadenas de ubiquitina unidas a Lys63. El reclutamiento de complejos de TAK1 múltiples para el andamio de poliubiquitinación TRAF6 llevaría los dominios de quinasa de TAK1 cerca uno del otro. Esto promovería la autofosforilación y activación de la quinasa TAK1, que a su vez puede activar el complejo IKK.

Figura 7 El complejo TAK1 y las deubiquitinasas regulan a la baja la señalización de NF κB. (a) Organizaciones de dominio de componentes complejos TAK1. (b) Estructura cristalina del dominio quinasa TAK1 en complejo con un péptido activador de TAB1. (c) Estructura cristalina de TAB2 NZF en complejo con di-ubiquitina unida a Lys63. (d) Organizaciones de dominio de las deubiquitinasas A20 y CYLD. (e) Estructura cristalina del dominio OTU de A20. (f) Estructura cristalina del cuarto dominio ZF de A20 en complejo con tres moléculas de ubiquitina. (g) Estructura cristalina del dominio USP de CYLD. La caja B es un pequeño dominio de unión a zinc similar a los dominios RING. Abreviaturas: NZF, dedo de zinc Npl4; OTU, dominio tumoral ovárico; USP, proteasa específica de ubiquitina; ZF, dedo de zinc.

REGULACIÓN NEGATIVA POR LAS DEUBIQUITINAS Las cadenas de poliubiquitina desempeñan un papel crucial en la activación de la vía NF-κB al proporcionar una plataforma de ensamblaje para moléculas de señalización. Por lo tanto, la eliminación de las cadenas de poliubiquitina por las deubiquitinasas (DUB) presenta una forma de terminar la activación de NF-κB. Al igual que las ligasas E3, los DUB pueden tener especificidad para ciertos tipos de enlaces de poliubiquitina. La especificidad puede estar mediada por la selectividad del núcleo catalítico, los dominios de unión a ubiquitina de la DUB o las proteínas adaptadoras. Se han encontrado varios DUB para regular la ruta NF-κB. Se ha demostrado que los DUB A20 (proteína 3 inducida por TNF-α), Cezanne, Usp21 y la hidrolasa de la ubiquitina carboxilo terminal CYLD son importantes para la regulación por retroalimentación negativa de la vía NF-κB. A20, CYLD, Cezanne y Usp21 difieren en su activación temporal y en la especificidad del enlace ubiquitina. Sin embargo, los cuatro DUB han sido implicados en la eliminación de cadenas de ubiquitina de RIP1 en la señalización de TNF. A20 pertenece a la superfamilia de tumores ováricos de DUB (72). Contiene un dominio tumoral ovárico N-terminal (OTU) y siete dominios ZF (Figura 7d). A20 es una enzima de edición de ubiquitina (19). Media la deubiquitinación de la poliubiquitina unida a Lys63, pero también puede generar cadenas de poliubiquitina unidas a Lys48 a través de la actividad de la ligasa E3 del cuarto motivo ZF (15, 19, 118). Ambas actividades son necesarias para la inhibición de NF-κB (32). También se mostró que el cuarto ZF (ZF4) de A20 se une selectivamente a las cadenas de ubiquitina unidas a Lys63 (6). Una estructura cristalina de ZF4 unida a monoubiquitina además de la caracterización en fase de solución reveló un sitio de unión de tres interfaces para la ubiquitina unida a Lys63. El dominio OTU de A20 se pliega en forma de cuña (Figura 7e). Se sugirió un parche de superficie muy conservado y cargado negativamente cerca del sitio activo de A20 como la región de unión a la ubiquitina (65). El sitio de unión putativo se ubica en una posición similar a los sitios de unión a ubiquitina de otros dos DUB, Yuh1 y HAUSP (36, 47). Se demostró que A20 elimina la totalidad de la cadena de poliubiquitina unida a Lys63 de TRAF6 en una etapa, con lo que se desactiva efectivamente la vía NF-κB (65). Se sugirió que el dominio ZF recluta las cadenas de poliubiquitina A20 a Lys63 en complejos de señalización activados. La OTU A20 desmonta las cadenas de poliubiquitina, que a su vez podrían facilitar la síntesis de cadenas degradantes de ubiquitina unidas a Lys48 en los sustratos (Figura 7f). CYLD es un miembro de la familia de la proteasa específica para la ubiquitina (USP). Contiene tres proteínas asociadas al citoesqueleto (CAP): repeticiones conservadas en glicina en su porción Nterminal y un dominio USP en el extremo C (Figura 6d). CYLD contiene una secuencia de unión a TRAF2, y se demostró que la tercera CAP interactúa con una secuencia rica en Pro en NEMO (58, 99). El dominio USP media el desmontaje de las cadenas de poliubiquitina unidas a Lys63. A diferencia de otros PSPs, CYLD es capaz de hidrolizar las cadenas de poliubiquitina internamente, resultando en una inhibición eficiente de la ruta NF-κB. La estructura del dominio CYLD USP reveló un sitio de unión a ubiquitina proximal cerca del sitio activo y un conjunto específico de Lys63 de residuos conservados cerca del centro catalítico, lo que explica la especificidad de Lys63 (Figura 7g). OBSERVACIONES FINALES Los estudios estructurales de la señalización de NF-κB han ayudado a ilustrar los mecanismos moleculares subyacentes en muchos aspectos de las cascadas de señalización desde el reclutamiento de adaptadores hasta la activación de las ligasas y quinasas de ubiquitina, que culminan en el control transcripcional de las respuestas inmunitarias e inflamatorias. Varios temas centrales están surgiendo de estos estudios. En primer lugar, la visión convencional de que la transducción de señales está compuesta por cadenas lineales de eventos se está desafiando porque se forman grandes conjuntos multiméricos, o señalosomas, en estos procesos de señalización. En segundo lugar, se han identificado al menos tres tipos de andamios de multimerización a partir de estos estudios: la oligomerización infinita de alto orden de TRAF6, la red de cadenas de ubiquitina y el ensamblaje

helicoidal en la superfamilia DD. En tercer lugar, la oligomerización parece ocurrir en todos los niveles de la cascada de señalización en la que múltiples oligómeros de señalización se combinan para formar señalosomas gigantes para realizar múltiples reacciones de manera simultánea y eficiente, como la ubiquitinación y la fosforilación. La cooperatividad intrínseca en la formación de señalosomas multiméricos puede predecir una respuesta de umbral digital en la señalización NF-κB, una propiedad que puede ser bastante general en muchos otros procesos biológicos. PUNTOS DE RESUMEN 1. Los factores de transcripción de la familia NF-κB son reguladores maestros de las respuestas inmunes e inflamatorias. 2. El NF-κB es secuestrado en el citosol por las proteínas IκB y se libera a través de cascadas de señalización específicas que conducen a la activación de IKK, la fosforilación de IκB y la degradación de IκB. 3. Los NF-κB se unen al ADN como homo o heterodímeros. 4. El IKKcomplex contiene una subunidad catalítica y la subunidad reguladora NEMOcapable de múltiples interacciones. 5. La señalización IKK está regulada por las ligasas de ubiquitina y DUB en las redes de cadenas de ubiquitina. 6. Las proteínas TRAF pueden formar conjuntos infinitos a través de dimerización y trimerización alternas. 7. Las proteínas DD en la señalización de NF-κB se ensamblan en señalosomas grandes utilizando simetría helicoidal. 8. La formación de grandes conjuntos de señalización utilizando diversos andamios estructurales puede ser un principio general en la señalización a NF-κB y otros procesos biológicos.