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RUSSELL, P.E. Sensitivity baselines in fungicide resistance research and management. FRAC Monograph No. 3. FRAC, CROP LIFE INTERNATIONAL

P E RUSSELL Independent Consultant Gog Magog House 263A Hinton Way Great Shelford

Cambridge CB2 5AN, UK SENSITIVITY BASELINES IN FUNGICIDE RESISTANCE RESEARCH AND MANAGEMENT.

Phill Rusell

Líneas Base de Sensibilidad en el Manejo e Investigación de la Resistencia a Fungicidas (traducción)

Contenido

Resumen Introducción Definición del termino “línea base” Cuando es necesario una línea base?

Cuales son las alternativas a una línea base normal? Línea base y la química de los fungicidas Procedimientos de muestreo, números de muestra y dosis de aplicación Ejemplos ilustrados de líneas base

Unión de datos a partir de otros cultivos y localidades Procedimientos de experimentación molecular Detectando cambios a partir de la línea base Uso de dosis discriminatorias

Líneas base y procedimientos reguladores en Europa Apéndice 1. Determinando un método de ensayo, procedimientos y parámetros de evaluación

Apéndice 2. Una nota sobre la detección de la resistencia y el tamaño de muestreo Apéndice 3. Riesgos y errores

Resumen La construcción de líneas base es ahora una principal tarea tomada por los científicos que trabajan en la industria de protección de cultivos y forma una parte del proceso de registro para todos los pesticidas. Esta publicación, escrita con un énfasis en este proceso regulador, será de mayor valor para el sector comercial y los Funcionarios Reguladores preocupados en examinar el componente de Evaluación del Riesgo de Resistencia de los nuevos Expedientes de Registro. Es, sin embargo, igualmente relevante para los científicos en el sector público que se deseen embarcar en estudios de manejo de la resistencia. El documento sigue el proceso de producción de líneas base a través de sus etapas lógicas: • Una consideración de lo que es una línea base, cuando es necesaria y cuales son las alternativas. La influencia de la química y el patógeno es resaltada junto con las consideraciones de otros productos en el mercado. • La conducción sobre lo que hace una buena línea base: la importancia de los métodos estándar, la influencia del número de muestreo y el origen y particularmente el área geográfica que esta siendo muestreada. Ejemplos reales y teóricos son usados para ilustrar los puntos discutidos. • Usar una línea base en la práctica: detectar los cambios y el uso de la unión datos para diferentes lugares y cultivos. Detectar los cambios a partir de la línea base y el uso de una “dosis de aplicación discriminatoria” para declarar las muestras prueba “resistentes” o “sensibles”. • Se discute la relevancia y el uso de los procedimientos de evaluación molecular, resaltando las ventajas así como las limitaciones actuales. • Se da un resumen de los requerimientos reguladores para Europa, ilustrando los diferentes tipos de datos requeridos. • Los apéndices proveen información sobre como establecer métodos de ensayos, la probabilidad de detectar resistencia y los peligros comunes y errores en la construcción de las líneas bases. INTRODUCCIÓN La resistencia a fungicidas y su manejo es de gran importancia para todos los interesados en la protección de cultivos. Sin el efectivo manejo del producto, puede surgir resistencia muy rápidamente, como sucede con los metil benzimidazol carbamatos (mbc), dicarboximidas y fenilamidas a comienzos de los 1980`s. Estos compuestos fueron introducidos sin el beneficio de estrategias adecuadas para el manejo de la resistencia, en gran parte debido a que el fenómeno de la resistencia era bastante nuevo y los principios científicos del manejo no estaban establecidos. Los primeros signos del desarrollo de la resistencia fueron los fallos en el control en campo de varias enfermedades, principalmente Botrytis cinerea en uva (mbc y dicarboximidas) y Phytophthora infestans en papa (fenilamidas). Los procedimientos para el manejo de resistencia son rápidamente ejecutados y han sido muy exitosos. No obstante, ellos fueron todos hechos en retrospectiva y sin el conocimiento completo de la naturaleza del perfil de sensibilidad/resistencia del hongo blanco.

Habiendo estas medidas fracasado, hay toda la probabilidad de que los compuestos sean retirados del mercado, conduciendo a una pérdida financiera para el fabricante que a su vez pueda conducir a menos inversión en nuevos químicos para la protección de cultivos, y una pérdida en productos valiosos para el usuario de tal forma que tenga que depender de productos más viejos, menos efectivos y ambientalmente menos amigables. Desde esos días, los costos de investigación y desarrollo de nuevos plaguicidas se ha incrementado, conduciendo a riesgos incrementados para que se hagan inversiones financieras. El desarrollo de resistencia es uno de los principales factores de riesgo involucrados y una compañía sabia es aquella que ahora asume un riesgo significante de que esto suceda para una nueva molécula y de esta forma planea manejarla desde el principio. Pero esto origina problemas. Como desarrollar estrategias antiresistencia? Como reconocer el desarrollo de resistencia, o más importante, hay maneras para monitorear la efectividad de un nuevo fungicida en un hongo de tal forma que el desarrollo de la resistencia pueda ser detectada antes de que sea un problema mayor y permita que se hagan procedimientos extra de manejo en su lugar? El elemento clave en la respuesta en responder estas preguntas es que usted debe conocer como responde su hongo blanco al fungicida antes de que el hongo sea expuesto a él en la práctica. Usted de este modo necesita conocer la línea base de sensibilidad para su combinación hongo/fungicida. Solo con esta información es posible monitorear el efecto del fungicida para ver si la respuesta está cambiando hacia resistencia. Este aspecto ha sido reconocido por las autoridades reguladoras en Europa, con la intención de proteger el ambiente y ayudar al usuario, mediante el aseguramiento de que los nuevos productos sean introducidos con una estrategia adecuada de manejo de la resistencia. Dentro de este esquema, se requiere de la provisión de datos para línea bases de sensibilidad para el registro de nuevas moléculas y el re-registro de las moléculas ya establecidas. DEFINICIÓN DEL TERMINO “LÍNEA BASE” La palabra “línea base” tiene muchos usos en el lenguaje mundial pero todos ellos incluyen el concepto de que es un punto de referencia para ser usado en un proceso de toma de decisiones. La “línea base” en un campo de tenis, por ejemplo, define el área de la cancha de tal forma que las pelotas se consideren “adentro” ó “afuera” de la jugada dependiendo de de que lado de la línea “base” ellas caen. Para la investigación y manejo de la resistencia a fungicidas una “línea base” puede ser definida como: Un perfil de la sensibilidad del hongo blanco al fungicida elaborado usando técnicas biológicas o de biología molecular para evaluar la respuesta de individuos ó poblaciones fungosas no expuestas previamente al fungicida. El uso principal de las línea bases es como una herramienta para el establecimiento de, y el subsiguiente monitoreo de, las estrategias de manejo de resistencia al fungicida. El termino línea base es aplicado universalmente a nuevos compuestos a

partir de química nueva pero cuando se aplica a moléculas para las que, por cualquier razón, no es posible encontrar una población que nunca haya sido expuesta al tipo de químicos asociados con la nueva molécula, pueden usarse frecuentemente los términos “perfil de sensibilidad” ó aún “perfil de introducción pre-mercado”. Para el propósito de este documento, los términos son intercambiables, dependiendo de la circunstancia. Por definición implícita, la línea base no es solo un punto de dato sino que es construido al muestrear un número de poblaciones ó individuos y al establecer la variabilidad entre ellos. La línea base, sin embargo expresada visualmente, matemáticamente ó de ambas formas, ilustrara esta variabilidad. En el uso practico, la línea base establece un punto de referencia sobre la aceptada sensibilidad fungosa a un fungicida. Los aislados ó poblaciones fungosas que se encuentran con un perfil de sensibilidad que caiga fuera de la respuesta línea base son considerados normalmente ser “menos sensibles” ó “resistentes” al fungicida. No se puede enfatizar muy firmemente en que la forma de la distribución de la línea base no da información sobre el riesgo absoluto de que se desarrolle resistencia en la practica. Sin embargo, si: •

la línea base muestra cualquier signo de adoptar un patrón disruptivo (ver después)

ó: • la línea base muestra una distribución sesgada con una cola larga para la terminación menos sensible y: • la parte alejada de la distribución puede estar asociada con una verdadera respuesta de resistencia entonces hay un claro peligro de que haya posible resistencia y de que deben tomarse estrictas medidas anti-resistencia antes de la introducción al mercado. La línea base producida seguirá siendo valida, pero el futuro énfasis del monitoreo comercial debe descansar en la evaluación del desarrollo verificado de segmentos resistentes en el tiempo, y posiblemente en la investigación de estrategias alternativas para el manejo a la resistencia. CUANDO ES NECESARIO UNA LÍNEA BASE? Los fungicidas son introducidos al mercado con blancos específicos para controlar. Cada uno de estos blancos, en teoría, requiere que se le establezca una línea base de tal forma que las estrategias de uso del producto puedan ser monitoreadas y pueda ser detectada la posible resistencia. Sin embargo, la experiencia sugiere que algunos blancos son muy propensos a desarrollar resistencia, otros son menos propensos y en algunos casos no ha habido ninguna evidencia real de desarrollo de resistencia a la fecha. Las consideraciones comerciales también tienen influencia.

Patógenos de alto y bajo riesgo: La Tabla 1, adaptada de la EPPO (2002) enlista los fitopatógenos de los principales mercados mundiales que han mostrados ellos mismos de ser capaces de hacerse resistentes a fungicidas en un lapso de tiempo suficientemente corto para ser una seria amenaza al éxito comercial y el valor al usuario de varios productos. Tabla 1. Fitopatógenos aceptados que muestran un alto riesgo de desarrollar resistencia a fungicidas. Patógeno Cultivo Enfermedad moho gris Botryotinia fuckeliana varios, especialmente uva _(Botrytis cinerea) trigo/cebada mildeo polvoso Erysiphe gruminis banano sigatoka negra Mycosphaerella fijiensis papa tizón tardío Phytophthora infestans uva mildeo mohoso Plasmopara vitícola Pseudoperonospora cubensis y cucurbitáceas mildeo mohoso relacionados arroz quemado del arroz Pyricularia orizae Sphaerotheca fuligenea y cucurbitáceas mildeo polvoso relacionados Venturia spp. manzano, pera roña Tabla 2. Fitopatógenos aceptados que muestran un mediano riesgo de desarrollar resistencia a fungicidas. Patógeno Cultivo Enfermedad lechuga mildeo mohoso Bremia lactucae arroz bakanae Gibberella fujikuroi* mancha foliar Leptosphaera nodorum trigo (Stagonospora nodorum) Monilia spp. Frutos de pepa y pomo pudrición monilia banano sigatoka amarilla Mycosphaerella musicola Peronospora spp. Varios mildeo mohoso manzano mildeo polvoso Podosphaera leucotricha Puccinia spp. trigo/cebada royas cebada mancha reticular de cebada Pyrenophora teres Tapesia spp. trigo/cebada mancha de ojo Uva mildeo polvoso Uncinula necator* * La línea directriz de la EPPO enlista estos patógenos como de alto riesgo y normalmente se requieren de línea bases.

En contraste, varios patógenos son considerados que presentan un bajo riesgo debido a que la resistencia generalizada no es un problema ó ha sido desarrollada de manera lenta. En algunos casos esto se debe indudablemente al patrón de uso del producto. Esto no significa que ellos nunca mostraran resistencia significante a los fungicidas en el futuro, sino que puede ilustrar una falta general de mecanismos para hacerse resistente en la práctica a través de cualquiera una propiedad inherentemente biológica del hongo (por ejemplo su epidemiología) ó por el patrón de uso de los productos diseñados para controlarlo. La Pauta de la EPPO (EPPO, 2002) no enlista estos y las decisiones sobre las línea bases de producción deben hacerse en base a revisiones de casos individuales. Los ejemplos son dados en la Tabla 2. Al usar esta lista debe mencionarse que la EPPO incluye a Gibberella fujikuroi y Ustilago necator en la Tabla 1, mientras que la FRAC

ve que ellos deben incluirse en la Tabla 2. La razón para esta diferencia de aproximación surge del hecho de que hay muy pocos datos laboriosos para clasificar los patógenos en grupos aparte de la experiencia histórica y la opinión así como los riesgos planteados por los patógenos. Consideraciones comerciales, patógeno y prioridades del mercado Algunos patógenos son de importancia local, pero en términos de mercado comercial son considerados como patógenos menores. Se duda de si alguna compañía comercial basara un moderno desarrollo del producto y campañas de venta en tales usos si no hay otro uso disponible para el nuevo producto. Por esta razón, es posible que no se justifiquen los costos involucrados en establecer una línea base y una campaña en marcha para monitorear año por año el perfil de sensibilidad al patógeno blanco. Esto no significa que las líneas base no puedan ser producidas. No hay razón científica del porque no, pero es más probable que ellas sean producidas como herramientas de investigación en situaciones donde el costo de su elaboración no es de gran importancia e.g., en la academia ó el sector público. Las decisiones sobre la elaboración de líneas bases deben hacerse en una base individual. Los típicos patógenos y enfermedades son dados en la Tabla 3. Tabla 3. Fitopatógeno de importancia comercial menor para los que una línea base puede no ser justificable por razones comerciales.

Patógeno Alternaria spp. Fusarium spp. y relacionados Hemileia vastatrix Phytophthora spp. (del suelo) Pythium spp. Rhizoctonia spp. Rhynchosporium secalis

Cultivo Varios Varios

Enfermedad manchas foliares fusariosis

Café Varios

roya damping off

Varios Varios cebada

Sclerotinia spp.

Varios

Tilletia spp. Ustilago spp.

cereales cereales

damping off pudriciones de pie y raíz manchado foliar/escaldado enfermedades de sclerotinia caries hedionda añublo

CUALES SON LAS ALTERNATIVAS A UNA LINEA BASE NORMAL? En algunos casos no puede ser posible establecer una línea base usando procedimientos de bioensayos. Esto puede ser por razones comerciales como se dieron arriba, ó debido a que no hay disponibles muestras no expuestas ó tal vez aún por dificultades biológicas. En tales circunstancias nosotros podemos aún necesitar un punto de referencia en contra del cual comparar el desempeño del producto como parte de la campaña de monitoreo. Esto puede hacerse al usar eficazmente los datos: Usar eficazmente datos como una línea base:

Durante la fase de desarrollo de la introducción del nuevo producto se conducen muchas pruebas en campo en donde se establece la eficacia del nuevo producto para el uso seleccionado. En muchos casos es razonable esperar que los patógeno(s) clave no han sido expuestos antes a este modo de acción y de esta formar representan una verdadera, no seleccionada población natural. La eficacia de la respuesta puede por lo tanto ser usada como una respuesta esperada en ausencia de resistencia. El futuro monitoreo de la eficacia puede de este modo ser usado como un indicador del posible desarrollo de resistencia, con alguna reducción en la eficacia debajo de un valor umbral acordado surgirán preocupaciones y se generaran investigaciones para examinar si se le puede imputar resistencia. En tales casos es muy importante eliminar todos los otros posibles casos de reducciones en la eficacia e.g., errores de aplicación, variaciones en la dosis de aplicación, intensas presiones de la enfermedad, etc., antes de que se concluya un estado de resistencia y se conduzca más resistencia. Un ejemplo de tales datos es dado en la Tabla 4.

Los datos provienen de evaluaciones de eficacia para un tratamiento a la semilla con prochloraz y carboxin en Alemania. En el momento de la introducción del producto (Abavit UT) se considero que el riesgo de desarrollar resistencia era bajo y no se obtuvo línea base. Se obtuvo datos de eficacia para varias pruebas de desarrollo y se continuaron reuniendo hasta 1998. Los datos muestran claramente que no hay disminución en la actividad del tratamiento a la semilla por un periodo de 14 – 15 años, indicando que no se ha desarrollado resistencia. Se obtuvieron datos paralelos para muchos más patógenos de semilla y todos mostraron no disminución en la eficacia con los años. Estas datos de eficacia son de este modo un sustituto excelente de una línea base. LINEA BASE Y LA QUÍMICA DE LOS FUNGICIDAS Una vez que se han hechos las decisiones acerca de la producción de líneas base basadas en consideraciones comerciales, los siguientes factores a considerar están basados en la química del nuevo fungicida.

La situación más clara respecta a un nuevo fungicida a partir de una nueva área de la química, pero también debe considerarse un nuevo fungicida a partir de química ya establecida. También es deseable construir una línea base para una molécula que ha sido usada por algún tiempo. En ambos de los últimos casos es posible que ya se halla llevado a cabo un cambio en la sensibilidad de la población antes de que la investigación sea ejecutada y los resultados deben ser considerados de acuerdo con eso. Nueva química, nuevo modo de acción Durante el descubrimiento, investigación y desarrollo de un nuevo fungicida, una compañía intentara determinar la modo bioquímico de acción de su nueva molécula. Solo en pocos casos raros se ha hecho esto antes de su introducción en el mercado, por ejemplo las estrobilurinas. Será normal, sin embargo, establecer si ó no el modo de acción es nuevo ó ya es conocido. Si el modo de acción es claramente nuevo, es bastante probable que no haya moléculas con un modo similar de acción en el mercado y por lo tanto no habrá conocimiento previo sobre las técnicas aconsejables para la determinación de la línea base. En contraste, con una molécula nueva para un modo de acción conocido, las técnicas ya pueden estar disponibles. Comercialmente, esta situación origina una curiosa posibilidad. Tal es el énfasis en la construcción de la línea base y en el manejo de la resistencia que muy frecuentemente la línea base y las estrategias de manejo serán definidos antes de que se determine el modo de acción. Esto sucedió para la molécula quinoxyfen. Es bastante seguro que otras compañías de investigación en protección de cultivos hayan estado investigando nuevas moléculas que pueden haber tenido un modo bioquímico de acción similar al del quinoxyfen pero debido a la confidencialidad de los procedimientos comerciales no había oportunidad de chequear la posible resistencia cruzada/sensibilidad entre las moléculas. La principal prioridad será por lo tanto establecer métodos para la evaluación de la sensibilidad del hongo al fungicida. Esto involucrara mucha investigación y, si el hongo involucrado es un patógeno obligado, puede volverse muy costoso en términos de recursos y financieros. La orientación sobre la selección de un método apropiado de ensayo es dado en el Apéndice 1. Nuevo fungicida, modo de acción establecido Para una nueva molécula a partir de un área química establecida es altamente probable que la investigación básica sobre técnicas de evaluación de la sensibilidad ya se hayan hecho y publicado. Es también posible que las líneas bases ya hayan sido publicadas para ciertas combinaciones de molécula/patógeno. Tal información puede ser invaluable al suministrar orientación sobre la producción de una línea base para la nueva molécula. Sin embargo, será peligroso asumir que tales técnicas y línea base establecidas pueden ser adoptadas a la nueva molécula. Esto es debido a que las moléculas individuales tienen curvas de dosis respuesta individuales y tendrán diferentes propiedades físico-químicas. La forma de las distribuciones de la línea base pueden de este modo diferir entre moléculas, ambos en relación a la dosis usada y las

respuestas obtenidas. Los datos proporcionados por Elcock et al (2000) ilustran esto bien para los fungicidas DMI y Mycosphaerella graminicola. Las técnicas establecidas necesitaran ser validadas para la nueva molécula y ser preparada una línea base específica para la molécula. Respecto a la FRAC puede revelarse convenientes técnicas e información. También es importante considerar el estado de la resistencia del patógeno a esta química. Si la química está bien establecida es posible que la resistencia ya sea conocida. Debe tenerse cuidado se asegurarse que la línea base sea construida a partir de aislados fungosos de poblaciones sensibles. El usar otras moléculas del área de esa química puede ser de gran ayuda aquí, junto con el uso de aislados resistentes referencia si ellos son disponibles. Línea base en retrospectiva para un producto ya establecido Esta situación puede ser similar a aquella de la de una nueva molécula a partir de una química establecida a condición de que la molécula que está siendo considerada provenga de un área de la química que ya ha sido investigada. Si la molécula a ser considerar es la única representante en el mercado para ese modo de acción y no hay investigación anterior sobre la sensibilidad a ella, entonces puede ser aún posible construir una línea base. Sin embargo, comercialmente puede no ser deseable gastar recursos en el establecimiento de una línea base a partir de estudios de bioensayos y una referencia basada en la eficacia puede bastar (ver la sección “Cuales son las alternativas hay para una línea base normal”), especialmente si la resistencia no es conocida. Si la resistencia es conocida ó se sospecha de esta situación entonces es un poco más complejo. En este caso, por definición debe haber una manera de detectar la resistencia y cuantificar la respuesta del hongo. Debe de este modo ser posible establecer una línea base (frecuentemente referida como un perfil de sensibilidad) basada en esta tecnología, pero debe tenerse cuidado de asegurarse que está construida principalmente a partir de aislados considerados ser sensibles, aunque el conocimiento de la ubicación de aislados resistentes puede ayudar en la línea base en la posterior toma de decisiones. PROCEDIMIENTOS DE MUESTREO, NÚMEROS DE MUESTRA Y DOSIS DE APLICACIÓN Varios autores han considerado la mejor manera para medir y muestrear las enfermedades vegetales. Tales procedimientos están generalmente diseñados para establecer la incidencia de las enfermedades vegetales y el daño (perdida) que causen. Las mediciones de la incidencia pueden ser hechas más de una vez por temporada. Muchos de los parámetros considerados en tales estudios son también aplicables a los procedimientos involucrados en el establecimiento de las líneas base de sensibilidad. Hay, sin embargo, diferencias en los objetivos y en la aproximación al problema acerca de la mejor manera para conducir la medición. La medición de la incidencia de una enfermedad a fin de producir información acerca de su distribución especial requiere del conocimiento de la epidemiología del patógeno y por lo tanto de los patrones de distribución espacial que pueden esperarse. Cuando se establece una

línea base, el conocimiento del patrón de distribución espacial será de mayor importancia que la incidencia de la enfermedad. Los procedimientos y patrones de muestreo pueden ser comunes, pero con una diferencia en los objetivos de manera que el establecimiento de la línea base parece parece muestrear y evaluar diferentes poblaciones fungosas en el lugar y no el predominio de propagulos fungosos ó el grado de daño causado por ellos. Procedimientos de muestreo Para el establecimiento de una verdadera línea base, las muestras deben ser obtenidas a partir de áreas y cultivos que no hayan sido tratados con el fungicida, ó con un fungicida con el que muestre resistencia cruzada, cualquiera en la temporada de la prueba ó en temporadas anteriores. Pueden presentarse excepciones cuando se desea producir una línea base en retrospectiva y son validas cuando no ha habido un caso de resistencia a condición que se acepte que pudo haber sucedido algo de selección contra los individuos más sensibles, a pesar de que no haya efecto en el desempeño en el campo del fungicida. En los casos donde la línea base está siendo construida para un nueva molécula a partir de química ya establecida para la que ya se conoce resistencia puede ser aconsejable construir la línea base usando muestras referencia a partir de colecciones establecidas de cultivos a condición que tales muestras puedan considerarse como no haber sido expuestas antes a esa área de la química. Cuando se están reuniendo muestras en fresco en el campo, cultivo ó parte de un cultivo, deben tomarse decisiones acerca de cómo muestrear el área prueba. El muestreo debe ser hecho al azar, ó tomar las muestras en el campo en forma diagonal ó en “W”. Es bastante aceptable rechazar muestras que no muestren la enfermedad en el punto de muestreo y seleccionar otra, planta enferma. Es aceptable debido a que el muestreo no esta siendo llevado a cabo con el fin de producir un mapa de distribución del patógeno a través del campo y no hay razón de enviar plantas no enfermas al laboratorio de prueba. Una unidad de muestreo puede comprender una parte individual de la planta e.g., un tallo de trigo para Tapesia spp., ó una hoja individual e.g., para Venturia inaequalis en manzano. El objetivo es obtener muestras que cubran amplio rango de variabilidad poblacional. Por esta razón es deseable algún conocimiento de la epidemiología del patógeno blanco de tal forma que se eviten procedimientos de muestreo que puedan seleccionar submuestras de la misma población en vez de diferentes poblaciones. De este modo, si se toman múltiples muestras de un relativamente “patógeno menos móvil” (por ejemplo Tapesia spp, Septoria nodorum) a partir de un campo, las muestras deben ser tomadas en toda el área disponible y no restringirse a una parte seleccionada del campo. Típicamente para esporas llevadas por el aíre e.g., Erysiphe graminis en cereales, es bastante probable que muestras de igual sensibilidad sean más ampliamente dispersadas especialmente si el muestreo es conducido durante la activa fase epidémica. Muy al principio de la temporada esto puede ser menos probable. En tales circunstancias la flora del aire contendrá generalmente más variabilidad que la

encontrada en un área restringida del suelo y el muestreo puede ser hecho usando aparatos especializados diseñados para muestrear grandes volúmenes de aíre. Número de muestreo y líneas base teóricas Se acepta que no hay disponibilidad de recursos ilimitados para el establecimiento de la línea base y que las limitaciones de recursos pueden determinar el número de muestras procesadas y por lo tanto el número de puntos de datos generados. La línea base debe representar la variabilidad de la población fungosa frente al fungicida. Un línea base generada a partir de un número limitado de aislados a partir de un número limitado de plantas a partir de un solo lugar tiene poca posibilidad de ser representativa de toda la población, aunque esta puede ser valida para esas circunstancias particulares. Las decisiones sobre el alcance de la línea base de este modo tienen que ser hechas teniendo objetivos claros en la mente y el conocimiento de la biología y estructura de la población del patógeno. Los datos referencia publicados a partir de líneas base para el hongo frente a otros fungicidas pueden dar algo de orientación. Cuando se consideran cuantos puntos de datos producirán una línea base representativa hay dos factores de variación a considerar: - la variabilidad inherente de los aislados fungosos individuales frente al fungicida, y; - la variabilidad introducida por el error experimental en el procedimiento de experimentación Nosotros deseamos medir el primero de estos y minimizar el segundo. Un método que tiene una alta variabilidad debido a los procedimientos experimentales será menos confiable que un método con una baja variabilidad. El uso de evaluaciones replicadas para el mismo aislado y dosis de aplicación puede ilustrar esta variabilidad y en algún grado el usar un valor promedio de las replicas ayudara en el control de la variación. Sin embargo, el exceso de variación entre las replicas (coeficiente de variación > 10%) puede indicar un fallo en el procedimiento de experimentación y una necesidad de un método más consistente. El objetivo es obtener un imagen realista de la distribución de la sensibilidad con el mínimo número de puntos de datos de tal forma que las desviaciones fuera de la distribución puedan ser identificadas en los subsiguientes ejercicios de monitoreo. Debido a las diferencias entre los patógenos fungosos y fungicidas es imposible ser prescriptivo acerca de cuantos puntos de datos se requieren para una situación dada, pero puede darse una orientación general: Claramente una línea base construida a partir de 5 puntos es improbable que sea de mucho uso a menos que los individuos en la muestra representen la variación de toda la población. Considere el hecho de que esto no se realizara hasta que más de 5 aislados hayan sido probados! Similarmente, una línea base construida a partir de 500 puntos puede ser excelente pero no siempre necesaria. Para la mayoría de los casos es probable que una línea base no se defina adecuadamente con menos de 20

puntos y es más probable que 50 puntos den una imagen razonable. Las líneas base que cubren amplias áreas geográficas probablemente requieran más puntos de datos que aquellas dirigidas a lugares específicos. La precisión con que tales desviaciones a partir de la línea base puedan ser detectadas dependerá de la precisión de su producción original. El número de puntos de datos seleccionados debe mostrar una respuesta predominantemente suave sin una línea divisoria para valores superiores e inferiores, seria muy difícil detectar los cambios en la sensibilidad. En tales circunstancias las dosis de aplicación usadas deben ser revisadas de tal forma que se incluyan lo límites de variabilidad de la población. Debe tenerse cuidado si la línea base termina abruptamente con una proporción grande de la población en una categoría de dosis (alta) en particular ya que es bastante posible que el procedimiento de muestreo no haya incluido los limites de la población ò las brechas entre las dosis de aplicación más altas son muy altas. Las dosis de aplicación seleccionadas para la evaluación deben cubrir el rango normal “sensible” de respuesta del aislado e incluir una aplicación que proporcione control total, pero debe también permitir una evaluación precisa de la forma de la respuesta de sensibilidad. Las dosis de aplicación usadas in-vitro tendrán con toda probabilidad poca relación a aquellas usadas en el campo debido a que la sensibilidad fungosa invitro es invariablemente mayor que aquella en el campo. Para algunos métodos invivo las dosis de aplicación en campo pueden ser aplicables. Ejemplos de líneas base teóricas son dados abajo para ilustrar la influencia del número de puntos de datos. Los ejemplos son mostrados como gráficos de líneas pero pueden igualmente ser producidos usando histogramas.

En la Figura 1, la respuesta muestra una típica distribución sesgada con la mayoría de los aislados siendo controlados en la dosis de aplicación 3. La respuesta luego cae con algunos aislados no siendo controlados hasta que no son controlados hasta que la dosis alcanza un valor de 9. Ningún aislado en esta muestra sobrevivió a una dosis de

aplicación de 10. Dese cuenta de la cola a partir de las dosis de aplicación 6 a 8. Si se desarrollo resistencia, la reducida sensibilidad de los aislados puede causar un cambio en el pico de la distribución a la derecha y debe ser bastante obvio. Alternativamente el pico a la dosis de 3 puede ser reducido e incrementarse el número de aislados que muestran una respuesta a las dosis de 6-10. En cualquier situación, la forma de la curva cambiara como mas aislados caigan en el área a mano derecha. Esto puede ser considerado como una línea base conveniente aunque el número de muestreo es bastante pequeño. En contraste, la figura 2 muestra una línea base muy irregular derivada a partir del tamaño de muestra y el criterio de prueba.

En la Fig. 2 es claro que el perfil de sensibilidad no es claro. El número máximo de aislados en cualquier categoría de dosis es 3 y no se ha alcanzado un punto control completo. Dese cuente también que debido al bajo número de aislados en cualquier categoría de dosis, como es que la respuesta produce una aparente línea irregular pero que en realidad está variando entre un mínimo de 1 y un máximo de 3 aislados en cualquier categoría. Los aparentes dos picos en las dosis de aplicación 2 y 5/6 son más probablemente artificios causados por los bajos números de muestreo. Ellos pueden, por supuesto, ser puntos reales e indicar un pico sensible en la dosis 2 y un pico “resistente” en la dosis 5, pero esto es improbable para un compuesto nuevo a menos que ya se conozca de resistencia ó ya se hayan observado irregularidades en el desempeño en campo del producto durante el desarrollo. Si es de interés, esta posibilidad debe ser investigada, pero una tarea más razonable será el revisar los procedimientos para establecer la línea base debido a que será muy difícilmente identificar cambios con certeza con el patrón de sensibilidad usado estos parámetros a menos que la selección haya causado un cambio masivo hacia la derecha. En una situación como esta la recomendación sería incrementar el número de aislados probados, incrementar la dosis en el extremo de la distribución de tal forma que se

obtenga un extremo final claro y también revisar los intervalos de las dosis de aplicación dentro del ensayo. La Figura 3 ilustra que puede suceder si el número de aislados es incrementado a 50 y las dosis de aplicación máximas se modificaron para dar un extremo final claro.

Dese cuenta como la forma de la línea base se ha vuelto más suave con un extremo final claro. La distribución de los puntos es más confiable y los cambios en el patrón pueden ser más fácilmente detectados. Dosis de aplicación e intervalos No hay un procedimiento establecido para determinar las dosis de aplicación a ser usadas. Las dosis pueden incrementarse de un modo logarítmico i.e., incrementadas en una secuencia de 1, 10, 100, 1000, 10000 etc. ó pueden basarse en una secuencia tal como: 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 etc. Las elecciones tienen que hacerse prior a la experimentación antes de la investigación de la línea base empiece. La secuencia no tiene que ser regular, y las condiciones pueden decidir que dosis son más estrechamente espaciadas en el extremo inferior del rango que en el superior. En general, sin embargo, cualquier análisis estadístico relevante puede hacerse más fácil si los intervalos de la dosis de aplicación esta espaciados regularmente. La Figuras 1-3 han ilustrado el uso de 10 dosis de aplicación. La Figura 4 ilustra que puede suceder si el número de dosis de aplicación es reducido, usando los datos a partir de la Figura 2.

En la Figura 4 dese cuenta como la forma general de la curva es más suave pero una comparación con la Figura 2 ilustra que esto es debido a que la variabilidad en la respuesta a la dosis de aplicación se ha escondido. La línea base producida de este modo no es satisfactoria debido a que no hay un claro extremo final y la respuesta está mostrando muy poca variación a lo largo de las dosis de aplicación. Solo si el subsiguiente monitoreo muestra un desplazamiento grande en la sensibilidad hacia la mayor dosis de aplicación y una subsiguiente perdida de los aislados más sensibles, la distribución será de algún valor. El procedimiento de la prueba debe ser revisado para incluir dosis de aplicación mayores y menores. Esto ilustra un hecho obvio, pero frecuentemente ignorado. Como el número de las dosis de aplicación se incremente, particularmente si los intervalos entre ellos son pequeños, la forma de la línea base estará relacionada al número de aislados probados, siendo producidas generalmente distribuciones más uniformes donde la relación numero de muestras/dosis de aplicación es baja. Las líneas base para herbicidas e insecticidas frecuentemente serán construidas a partir de menos puntos de datos que para un fungicida. Las razones para esto son ambas biológicas y practicas. Las malezas son bastante menos móviles que los hongos y las poblaciones dentro de un área dada probablemente son menos variables debido a esta restringida movilidad. Son de este modo necesarias menos muestras para cubrir la variabilidad poblacional. Los insectos son más móviles y capaces de dispersarse a través de áreas más amplias que las malezas. Pero comparados a los hongos, el número de individuos producidos por generación es mucho menor y las diferencias entre las poblaciones de individuos probablemente muestren menos variabilidad. El probar múltiples muestras de malezas e insectos también origina problemas prácticos de transporte, multiplicación y mantenimiento en el laboratorio prueba. Expresando la línea base

Las figuras 1-4 han sido expresadas como curvas de frecuencia simples pero ellas pueden haber sido fácilmente expresadas como histogramas y mostrar la misma información. Las dosis de aplicación expresadas en el eje x son mostradas igualmente espaciadas pero en realidad más probablemente se transformaron de una forma tal a una escala que se corra en base a una escala logarítmica ó no lineal. Más recientemente, se ha mostrado mucho interés en el uso de la distribución logarítmica. Las curvas de frecuencia pueden haber sido expresadas como curvas de frecuencia acumuladas como se muestra en la Figura 5 para los mismos datos mostrados en la Figura 3.

Una ventaja de la curva de frecuencia acumulativa es que es progresiva y puede ser fácilmente usada en las subsiguientes campañas de monitoreo para buscar cambios visuales en el lugar preciso y diferencias entre poblaciones. Recuerde, sin embargo, que el aumento más pequeño registrado en el eje Y (% de frecuencia acumulativa) será dado por “100 + número de aislados”. Así que sí el número de aislados es 20, el aumento más pequeño (%) será del 5% y de 2% para 50 aislados. La frecuencia acumulativa puede ser también expresada como un histograma. Los gráficos de torta también pueden ser usados pero se consideran de poco valor para ilustrar los cambios en el patrón de distribución. Distribución geográfica de la línea base La línea base tiene uso para un área restringida como un distrito local, ó país, ó continente (e.g., Europa) ó es de uso global? Si los proyectos comerciales limitan el desarrollo del producto a un país particular es claro que la línea base debe concentrarse en ese país en primer instancia pero si esos proyectos son hechos para expandir el conocimiento deben cambiar los proyectos de introducción del producto. Como utilizaremos los recursos usados en la construcción de la línea base? Al considerar un país individual, es razonable asumir que las respuestas de sensibilidad son iguales para todo el país? Podemos nosotros asumir que una línea base producida para un país e.g., Inglaterra, se aplicara a otro, e.g., Francia? La respuesta a esta pregunta puede tener serias consecuencias relacionadas a la cobertura del muestreo

para la línea base. Para obtener una línea base verdadera para un país, los aislados muestreados deben ser representativos de toda la variabilidad poblacional presente en ese país. Los sesgos en el muestreo deben ser ausentes. De este modo será imprudente creer que las muestras derivadas a partir de un campo representaran un país y una mejor estrategia será construir la línea base a partir de muestras en campos para diferentes áreas del país. Si el tamaño de la muestra del campo individual es adecuado será posible determinar si ó no existen diferencias regionales en el país, y sí no las hay, reunir los datos para una línea base general del país. La experiencia a la fecha indica que para una nueva molécula a partir de una nueva química los perfiles de sensibilidad de las poblaciones en un país individual son probablemente similares y que la principal preocupación es asegurar que las muestras probadas ilustren los extremos de la variabilidad en la población. Este concepto puede expandirse para considerar una línea base individual para diferentes países, pero con la siguiente cláusula: Solo puede ser razonable esperar que una línea base a partir de un área se aplicará a otra área si todas las condiciones de crecimiento del cultivo y desarrollo del patógeno son tan idénticas como sea posible. Puede de esta forma ser bastante razonable asumir que una línea base establecida para un patógeno cereal en Inglaterra puede también ser aplicable para Francia del norte ó Alemania donde las condiciones del cultivo son similares. No puede ser razonable usar una línea base desde Europa como un punto de referencia para e.g., Australia o Nueva Zelanda. Hay, sin embargo, maneras de establecer si tales patrones de datos comunes pueden ser usados y de ese modo evitar la innecesaria duplicación del esfuerzo en la construcción de las líneas base (ver “Unión de datos a partir de otros cultivos y localidades”). EJEMPLOS ILUSTRADOS DE LINEAS BASE Los siguientes ejemplos han sido elegidos para ilustrar diferentes aproximaciones de compañías de protección de cultivos para la producción de líneas base en la practica durante la fases de desarrollo de moléculas individuales. Nueva química Ejemplo 1. Distribución de frecuencia: famoxadone y Plasmopara viticola La Figura 6 ilustra la distribución de la línea base de sensibilidad para el compuesto QoI famoxadone y Plasmopara viticola. En el momento de la producción de esta línea base, el modo de acción de los compuestos QoI era conocido pero ellos no habían sido introducidos para uso a escala mayor en el mercado del mildeo velloso de la vid. Es razonable asumir, por lo tanto, que la mostrada distribución de la sensibilidad es una verdadera distribución no seleccionada “natural”.

La línea base fue construida usando un ensayo in-vitro basado en el efecto inhibidor del famoxadone en la liberación de las zoosporas de P. viticola a partir del esporangio usando nueve concentraciones de fungicidas en el rango de 0.001 a 3 mg/l. Las muestras fueron obtenidas de Francia, Italia, Portugal, España, y Alemania. Después de la prueba, se calculo un valor EC50 para cada aislado mediante análisis de probit y los valores fueron agrupados en las categorías mostradas. El análisis estadístico mostró que no habían diferencies en los perfiles de sensibilidad entre países y los datos fueron de este modo combinados para dar una línea base general. La confiabilidad del procedimiento de prueba fue chequeada y confirmada al incluir un aislado referencia en 28 pruebas consecutivas. Este es un ejemplo de una línea base que puede permitir que las salidas del patrón respuesta sensitivo esperado sean fácilmente identificadas. Los detalles completos son dados por Genet & Vincent (1999). Ejemplo 2: distribución de frecuencia acumulativa: anilinopirimidina y Botrytis cinerea La Figura 7 muestra una línea base construida como una curva de frecuencia acumulativa para la sensibilidad de Botrytis cinerea al fungicida anilinopirimidina pyrimethanil. Al momento de construcción las poblaciones fungosas habían sido expuestas a los fungicidas anilinopirimidinas y era razonable esperar que el perfil de sensibilidad fuera representativo de variación natural. Las muestras venían de las principales áreas de cultivo de la vid de Francia. Debido al gran tamaño del muestreo (>600) fue posible establecer que no habían diferencias regionales de tal forma que los datos fueron combinados para dar una línea base para “toda Francia”. Los datos fueron generados usando un método de microtitre plate que media la germinación y el subsiguiente crecimiento de las esporas fungosas en un medio definido para un rango de varias concentraciones. A partir de estos datos, se calcularon los valores IG50.

Dese cuenta que las dosis de aplicación fueron dibujadas a una escala logarítmica. La distribución muestra que hay una baja proporción inicial de la población que es controlada a muy bajas concentraciones de pyrimethanil, la población controlada luego aumenta rápidamente como la concentración del fungicida aumenta. Hay una pequeña proporción de la población que no es controlada hasta que el fungicida alcanza valores concentración mayores, pero no hay aislado que sobreviva a concentraciones de 100 ppm. Química vieja, nuevo uso, no hay conocimiento previo Ejemplo 3: propamocarb y Phytophthora infestans El propamocarb ha sido usado por muchos años en el mercado hortícola para control de Pythium y Phytophthora spp. del suelo y algunos mildeos vellosos foliares sin problemas de resistencia antes de ser introducido para el control de Phytophthora infestans en papa. Debido a esta historia, se había concluido que el riesgo de desarrollar resistencia era bajo, especialmente si era introducido en mezclas con moléculas establecidas de bajo riesgo, multisitio. Sin embargo, P. infestans es un patógeno de alto riesgo y la posibilidad de desarrollar resistencia no puede ser ignorada. Se estableció una línea base (Figura 8) junto con una campaña de monitoreo de la sensibilidad como para del programa de gestión del producto. El método usado fue virtualmente idéntico al método del disco foliar flotante desarrollado para las fenilamidas. El criterio evaluado fue el desarrollo de lesiones esporulantes en los discos foliares de papa, y se calculo el grado de esporulación medio para cada serie de discos foliares usando el siguiente sistema de grados: Grado Criterio 0 Esporangióforo ausente 1 1-4 esporangióforos por disco 2 5-12 esporangióforos por disco 3 Esporulación moderada, solo visible bajo microscopio binocular 4 Esporulación abundante visible a simple vista

Los datos, presentados aquí en forma de histograma, ilustran el perfil de sensibilidad y pueden ser fácilmente convertidos a una línea de regresión si se requiere un análisis matemático.

Nueva química, modo de acción establecido, algo de selección previa Ejemplo 4: Spiroxamine y mildius polvosos de cereales La spiroxamine es un fungicida SBI con un modo de acción idéntico a la acción de las morfolinas (tridemorph, fenpropimorph) y fenpropidin. Estos últimos fungicidas han sido usados en cereales para el control de Erysiphe graminis para muchos años y aunque no se ha encontrado resistencia que conduzca a fallos en el campo ha habido signos de algunos pequeños cambios en la sensibilidad de la población. La spiroxamine fue de este modo introducida en una situación donde se había presentando muy probablemente selección previa. En este situación fue necesario construir una línea base para la spiroxamine a fin de monitorear su desempeño futuro dentro del grupo químico en conjunto. Una explicación completa del trabajo y los métodos usados son presentados en Felsenstein & Kuck (1998). El método analítico elegido fue el establecer los valores EC50 de la población para varias poblaciones europeas y, así usar un aislados referencia estándar, calcular el “Factor de Resistencia, RF” como la relación de la probada EC50 poblacional con la EC50 del aislado referencia estándar. Al usar este cálculo relativamente sencillo fue posible detectar cambios posibles en la sensibilidad de la población con el tiempo. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 9.

Los datos en la Figura 9 muestran que hubo una clara diferencia en la sensibilidad de las poblaciones del mildeo en toda Europa, estando las poblaciones más sensibles en el sur. UNIÓN DE DATOS A PARTIR DE OTROS CULTIVOS Y LOCALIDADES En algunos casos puede no ser económicamente viable construir una línea base para un uso específico. El uso de datos de eficacia como un sustituto puede ser considerado una opción pero hay casos donde esto no es deseable, particularmente con químicas nuevas y patógenos muy importantes. En tales circunstancias es posible usar la “unión de datos” para permitir que una línea base previamente establecida sea usada en una nueva situación. Los siguientes ejemplos ilustraran los principios: Extender una línea base a una nueva área geográfica Para un patógeno principal es lógico que la línea base sea construida para áreas donde el uso del producto será probablemente intensivo. Como ejemplo, para los fungicidas de cereales los principales mercados pueden centrarse en Francia, Alemania y el RU y es razonable que una línea base sea establecida cualquiera conjuntamente ó individualmente para estos países. Pero las enfermedades de los cereales pueden también aparecer en otros países europeos y puede ser deseable tener una línea base aplicable para esos países extra. Es posible usar la línea base establecida para ese país extra? La respuesta más probablemente es “si”, pero necesita ser comprobado mediante la unión de datos. El proceso es sencillo. Para confirmar que la distribución establecida es aplicable para el nuevo país es necesario probar un número de aislados del nuevo país y mostrar que ellos caen dentro de los límites de la línea establecida. Una vez que esto se ha establecido es posible usar la línea base con confianza para el nuevo país.

En la práctica, se pueden usar unidades de información para sostener las conclusiones. Si la línea base establecida ha sido construida para un número de países, y si se muestra que las distribuciones del país individual no difieren de los otros, entonces es razonable concluir que hay una sensibilidad común en la población dentro del amplia área geográfica cubierta. Tal situación es mostrada en la Figura 10 para las distribuciones de sensibilidad de Gaeumannomyces graminis f.sp. tritici, la causa del take-all en trigo, para fluquinconazole. Los datos muestran claramente que las distribuciones de sensibilidad son comunes para estos tres países. Esto le da confianza adicional al uso de una línea base combinada de G. graminis f.sp.tritici / fluquinazole para Europa sin la necesidad de extensas experimentaciones en otros países.

Debe tener cuidado, sin embargo, al usar esta aproximación. En el ejemplo de arriba no hay grandes diferencias entre los aislados dentro de los países individuales. Si tales diferencias han sido encontradas esto puede indicar diferencias entre poblaciones locales, lo que, si son lo suficientemente grandes crearan problemas en la interpretación de datos durante las subsiguientes operaciones de monitoreo. Extender una línea base para un cultivo diferente Esto es solo posible cuando la misma especie de patógeno es responsable de causar la enfermedad en todos los cultivos de interés. Tal situación puede ser ilustrada refiriéndose a B. cinerea. El principal mercado para el control de este patógeno está en las uvas para el control de moho gris, particularmente en Francia. Es de este modo razonable esperar que se establezca una

línea base para este uso en Francia, extendiéndose posiblemente la línea base mediante la unión de datos para incluir otros países. Pero B. cinerea también causa el moho gris en una amplia variedad de otros cultivos e.g., fresa, pimienta, tomate, vara. La justificación económica para producir líneas base específicas del cultivo para tales cultivos es cuestionable pero es posible usar la misma aproximación de “unión de datos” como se uso para las nuevas áreas geográficas. Las muestras deben hacerse a partir del nuevo cultivo y el perfil de sensibilidad de un rango de aislados ser comparado con la línea base de sensibilidad establecida para el cultivo principal. Al contemplar que los aislados se ajustan a la línea base establecida debe ser posible usar con confianza la línea base establecida para el nuevo cultivo. Tal aproximación fue usada cuando se establecieron líneas base para la sensibilidad de B. cinerea a pyrimethanil para uva y tomate. Se estableció una extensa línea base para las uvas de Francia y Suiza, no encontrándose diferencias entre los países. Los aislados a partir de tomates de España se ajustaron bien a la distribución para uva, aunque es un grupo que mostró menos variación que los aislados de la uva y presentaron una diferente respuesta promedio. En general, sin embargo, y ya que los datos a partir del tomate se contuvieron completamente dentro de los datos de distribución para uva, se concluyo que el rango de respuestas de sensibilidad encontrado a partir de las uvas puede ser tomado cono una buena señal de la variación de la población que probablemente se presente en el tomate. Se hicieron aproximaciones similares (no publicadas) para establecer que la línea base para la uva era también aplicable para las fresas. PROCEDIMIENTOS DE ESPERIMENTACIÓN MOLECULAR Se han hecho grandes avances en el desarrollo de procedimientos de análisis molecular para identificar y monitorear el desarrollo de la resistencia en patógenos vegetales. En teoría, una vez que un marcador molecular es disponible para identificar la resistencia en el patógeno debe ser un asunto sencillo el usar la tecnología para buscar la resistencia en las poblaciones blanco y el evaluar el efecto de las varias estrategias de manejo en su desarrollo. La cuestiones de tamaño de muestreo, la distribución del muestreo y otros aspectos cubiertos anteriormente, permanecen sin cambiar. El principal problema con el uso de tal tecnología es que, por definición, la resistencia debe ser identificada antes de que se puedan desarrollar procedimientos de prueba adecuados. En las situaciones donde la base molecular de la resistencia no se conoce será de este modo imposible usar métodos moleculares para establecer una línea base. Tal vez el ejemplo más ampliamente publicado del uso de técnicas moleculares en el establecimiento de una línea base y el subsiguiente monitoreo del desarrollo de la resistencia es dado por el grupo de fungicidas QoI, incluyendo los derivados de las estrobilurinas azoxystrobin, kresoxim-methyl, trifloxystrobin, pyraclostrobin,

picoxystrobin, fluoxastrobin, la oxazolidinediona famoxadone y la imidazolinona fenamidone. Estos fungicidas actúan al inhibir la respiración fungosa en el complejo III (complejo citocromo bc1) al ligarse a la ubiquinona oxidante (lado exterior) de la membrana mitocondrial. La base molecular para la resistencia a este modo de acción fue identificado primero por Di Rago et al. en 1989 y se han descrito once posibles mutaciones puntuales que pueden causar la resistencia. Para la mayoría de poblaciones patógenas es ahora aceptado que la resistencia puede ser debida a cambios en el gen del citocromo b, en particular una mutación en la posición 143 que confiere la resistencia. La mutación cambia la glicina a alanina, por la tanto la nomenclatura G143A. Este marcador ha sido usado por la mayoría de compañías y los laboratorios investigación del sector público para monitorear la resistencia de varias poblaciones fungosas. Cuando se usa tales tecnologías, el concepto de una “línea base de sensibilidad” desaparece en gran parte. Es reemplazado por la distribución de la frecuencia del gen mutante en las poblaciones fungosas. En si mismo este puede actuar como un punto de referencia a condición de que el monitoreo futuro sea conducido usando técnicas idénticas, debe ser posible identificar los incrementos en las frecuencias del gen mutante (resistente) como un resultado del uso del fungicida. Desafortunadamente, el uso de tales técnicas no es tan simple como puede parecer. Las investigaciones conducidas por los miembros de la compañía de la FRAC han mostrado que es posible detectar mutaciones G143A en poblaciones fungosas que nunca se expusieron a los fungicidas QoI. De este modo parece ser que la mutación se presenta naturalmente en las poblaciones fungosas, a pesar de las bajas frecuencias. Pueden también encontrarse, otra vez bajas, pero variables, frecuencias, en situaciones donde el uso de productos basados en QoI están dando un control de la enfermedad perfectamente aceptable. El problema actual es que no siempre es posible correlacionar la frecuencia de la detección de la mutación con la probable disminución en el desempeño en campo del fungicida. Los dos aspectos son de particular interés. La mutación G143A se presenta en un gene mitocondrial. Al nivel de aislado fungoso individual, no es aún cierto que frecuencias de los genes mutantes en una célula fungosa particular son requeridas para que se presenten células resistentes al fungicida. También no es claro que proporción de los aislados “resistentes” es necesaria en una población en campo para que conduzcan a un fallo en el control de la enfermedad. En tales situaciones el monitoreo mediante las técnicas moleculares debe estar apoyado por la observación cuidadosa del desempeño en campo y de evaluaciones de resistencia estándar invivo/in-vitro a fin de corregir las conclusiones que se puedan obtener. Ni se debe asumir que la mutación G143A es lo único que opera. La resistencia de V. inaequalis a los fungicidas QoI no es siempre dependiente de esta mutación y más recientemente se ha identificado una segunda mutación, F129L, en Magnaporthe grisea y Pythium aphanidermatum así como en P. viticola en uva y Alternaria solani en papa. Es urgentemente necesario más investigación sobre estos fenómenos.

DETECTANDO CAMBIOS A PARTIR DE LA LINEA BASE La línea base es usada como un punto de referencia para evaluar si ó no se está desarrollando resistencia durante el uso comercial de la molécula en riesgo. Esto se consigue al muestrear a partir de áreas que usen el producto y al conducir ensayos de sensibilidad usando los mismos protocolos usados para establecer la línea base. Se preocupa de que se pueda estar desarrollando resistencia cuando el patrón de distribución de sensibilidad observado en la práctica comercial se desvía de aquel mostrado en la línea base. Asumiendo que no se detecto resistencia como parte de la distribución de la línea base, se dará énfasis en buscar cambios en la forma, ubicando ó segmentando los perfiles de sensibilidad obtenidos a partir de poblaciones de aislados fungosos expuestos el fungicida comparándolos con la línea base. En la conducción de tales estudios, deben tenerse en cuenta varios factores: • •

Los tamaños de la muestra deben ser lo suficientemente grandes para permitir que se alcancen conclusiones razonables. La probabilidad de detectar resistencia está relacionada con el tamaño de la muestra (Apéndice 2) El área de muestreo debe ser definida claramente; puede ser un campo, huerto, viñedo ó una región geográfica o país.

Independiente del origen de las muestras de prueba, se deben observar varias reglas cuando se conducen tales estudios. • • • • •

La línea base que está siendo usada debe ser apropiada en términos del cultivo, patógeno y región geográfica. Los métodos usados deben ser idénticos a aquellos usados para establecer la línea base. Los procedimientos de recolección, transporte, almacenamiento, purificación y preparación del inóculo deben corresponder a aquellos usados para la línea base. Se deben de obtener detalles completos de la historia del muestreo tales como el régimen de tratamiento en esa temporada y temporadas previas, y la historia del cultivo. Se requieren de datos sobre el desempeño del fungicida en el control del patógeno de tal forma que la eficacia puede ser comparada con la sensibilidad.

Una vez que estos criterios se han reunido es posible proceder con el ensayo de monitoreo y revisar si ha habido un cambio en la sensibilidad. Cuidado en la interpretación de los datos Se debe tener extremo cuidado en llegar a conclusiones ya que es muy fácil concluir que han ocurrido cambios cuando no es así. Los siguientes ejemplos ilustran esto:

Ejemplo de datos a partir del programa de monitoreo para quinoxyfen y E. graminis son mostrados en la Figura 11. Los datos de la línea base original fueron publicados por Hollomon et al (1997). Se recolectaron esporas en una trampa de esporas a chorro montada en carro en varias regiones de Europa en cada año y se evaluaron la sensibilidad usando hojas de trigo rociadas con un rango de concentraciones de quinoxyfen. La EC50 de cada aislado fue calculada usando un análisis de probit. Para validar las comparaciones entre años, se incluyeron aislados referencia estándar que representan una población no tratada de inicios de los 1970. Los datos mostraron que se presentaron diferencias entre años, con 1998 y 1999 mostrando un aparente incremento en la sensibilidad como una los valores EC50 disminuyeron. Sin embargo, también se presentaron diferencias en los aislados referencia, y así se pudo atribuir a la variación experimental. Es claro que no hay desviación para los patrones de sensibilidad vistos en comparación a los aislados referencia. Sin una consideración cuidadosa de todos los datos y la inclusión de los aislados referencia, pudo haber sido difícil entender que estaba sucediendo.

Una situación similar es ilustra en la Figura 12 para pyrimethanil y B. cinerea para viñedos franceses.

Los datos presentados en la Figura 12 muestran varios puntos muy importantes: •

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En 1995, el año cuando se estableció la línea base, fueron tratadas una serie de parcelas usando la acordada estrategia manejo de la resistencia. Los datos mostraron claramente que el perfil de sensibilidad fue idéntico entre las dos series de datos i.e., no se desarrollo resistencia como un resultado de la estrategia de manejo. En 1996, el perfil de sensibilidad parece moverse a la izquierda, un posible indicio de un desplazamiento a mayor sensibilidad. Sin embargo, mientras que tal fenómeno no es imposible, su asocio con el tratamiento a fungicidas es ilógico. Puede, por lo tanto, cualquiera ser un ejemplo de la variabilidad en los procedimientos de experimentación de un año al siguiente ó un ejemplo de verdaderos cambios en la sensibilidad en la población de un año a otro sin influencia del tratamiento químico. En 1997 el perfil de sensibilidad mostró una aparente disminución en la sensibilidad ya que la línea se movió a la derecha. Dese cuente, sin embargo, que el valor máximo de IG50 no ha cambiado. Esto pudo haber sido interpretado como un desplazamiento hacia una sensibilidad menor, pero teniendo en mente la variabilidad vista en 1996 no fue considerado probable y se pensó que se debía a la variabilidad natural en la población de B. cinerea. Esto fue apoyado por observaciones en la eficacia del producto en el campo; sin haberse observado problemas. Las conclusiones a partir de 1997 fueron apoyadas por los subsiguientes monitoreos de datos para 1998, 1999, y 2000. Todas estas distribuciones mostraron respuestas similares a la línea base de 1997 aunque hubo algo de variación alrededor. De este modo no hubo razón para sospechar un cambio en la sensibilidad.

La conclusión importante a partir de estas investigaciones es que puede ser peligroso sacar conclusiones a partir de una comparación de un solo año. Un ejemplo de un cambio respecto a la línea base Un ejemplo confirmado de un cambio respecto a la línea base de sensibilidad es mostrado en la Figura 13 para Venturia inaequalis y el QoI kresoxim-methyl. La línea base original de 1996 era una típica distribución normal logarítmica, pero es claro el desplazamiento a un nivel muy reducido de sensibilidad para algunos aislados de Alemania en 1999.

USO DE DOSIS DISCRIMINATORIAS El establecimiento de líneas base mediante el uso de procedimientos de bioensayos descritos en esta monografía ha involucrado el uso de un rango de dosis y la evaluación de los aislados fungosos para cada dosis. La sensibilidad de los aislados puede de este modo ilustrarse en una distribución continua. Aunque no es imposible, es improbable que la línea base abarcare aislados que fueran “resistentes” y capaces de causar un control fallido en el campo. Sin embargo, cuando después de monitorear las ventas esta es conducida después del uso intensivo del producto y cuando estos cambios que se alejan de la línea base pueden ser detectados de tal forma que algunos aislados se consideren resistentes, puede ser posible simplificar el procedimiento de monitoreo y usar una dosis discriminatoria. Una dosis discriminatoria es una sola dosis de aplicación a la que, dependiendo de la reacción del aislado fungoso, es posible declarar al aislado sensible ó resistente, aunque es posible que en algunas circunstancias se divida la categoría “sensible” en ulteriores sub-divisiones e.g., sensible, menos sensible. La dosis de aplicación usada y el criterio de reacción para la prueba deben ser cuidadosamente definidos y acreditados por extensas investigaciones para predecir de manera precisa la situación en campo. El procedimiento prueba usado puede ser idéntico a aquel usado para establecer la línea base ó puede ser modificado. Debe, sin embargo, permanecer inalterable a través del ejercicio del monitoreo a menos que se hagan las protecciones adecuadas para validar una cambio en el procedimiento. Un procedimiento común es seleccionar una sola dosis de aplicación basado en las respuestas de aislados a partir de situaciones conocidas de resistencia en el campo y medir la respuesta de los aislados prueba a esta dosis de aplicación. Las pruebas en placas de agar in-vitro son populares para este procedimiento, siendo el crecimiento del aislado prueba registrado como un % de su crecimiento en ausencia del fungicida prueba. Un aislado resistente es frecuentemente definido como uno con un crecimiento del 50% ò más en presencia del fungicida.

Las respuestas obtenidas pueden depender de la naturaleza de la resistencia a ser investigada. En situaciones donde la resistencia es disruptiva (Figura 14) y la población fungosa puede ser dividida en dos distribuciones discretas, una sensible y la otra resistente, la dosis discriminatoria puede ser ubicada de tal forma que se obtenga una clara respuesta “mas” ò “menos”. Sesgando la dosis de aplicación hacia la parte verdaderamente resistente de la distribución se eliminaran respuestas cuestionables de sensibilidad.

Tales situaciones están más probablemente asociadas con mecanismos de resistencia bajo el control de un solo gen, y en ausencia de otra información, puede ser un útil indicador de resistencia que se deba a una mutación unisitio. Que puede estar preocupando si una imagen con patrón disruptivo emerge durante la producción de la línea base antes de que el producto haya alcanzado el mercado. En estas circunstancias pueden hacerse varias preguntas, la más importante de las cuales es si ò no el segmento aparentemente resistente de la población es verdaderamente resistente. Los ensayos adecuados deben ser diseñados para responder a esta pregunta. Puede también suceder que el segmento aparentemente resistente es de “resistencia intermedia” ò puede ser clasificada como “menos sensible”. De nuevo, esto necesitara ser establecido. Si una porción verdaderamente resistente de la población se encuentra en el proceso de composición de la línea base esto no significa necesariamente que se desarrolle rápidamente la resistencia en la practica, pero puede indicar un riesgo que debe ser tomado en cuenta cuando se establezcan las estrategias de manejo de la resistencia. Si el patrón de resistencia no es disruptivo sino continuo (Figura 15), puede ser más difícil el hacer una demarcación entre las categorías sensibles y resistentes debido a que los individuos en la población probablemente muestren un rango más amplio de respuestas. Esto plantea una dificultad en la interpretación y clasificación de las respuestas de los aislados que muestren crecimiento en el rango de 40-49% debido a que tales aislados no son completamente sensibles pero, de acuerdo al criterio establecido, no son resistentes. El ignorar su respuesta y registrarlos como

“sensibles” puede ser visto como el ignorar información valiosa debido a que ellos pueden representar un indicio de un movimiento de toda la población hacia un estado más resistente. Por esta razón puede ser valioso dividir el rango “sensible” en divisiones ulteriores. Las subdivisiones luego se vuelven en ulteriores seudo-líneas base y se puede obtener información valiosa al monitorear la evolución de esta distribución en el tiempo.

Se estableció un procedimiento de esta manera para prochloraz y mancha de ojo (causada por Tapesia spp.) en trigo. La dosis discriminante seleccionada fue de 0.5 ppm prochloraz y el criterio para el establecimiento de la resistencia es el crecimiento del 50% ó más a estas dosis comparado al crecimiento del agar no enmendado (PDA). Se uso la dosis discriminatoria ya que se registro resistencia en el norte de Francia en 1991. Los datos obtenidos usando esta dosis para un número de años son mostrados en la Figura 16.

Los datos muestran que en 1991 la resistencia no fue extensa pero se incremento en frecuencia en los últimos años hasta que en 1998 una gran proporción de la población se considero resistente y la de aislados verdaderamente sensibles (aquellos que muestran mínimo crecimiento a 0.5 ppm prochloraz) se había vuelto muy baja. La técnica ha sido usada subsiguientemente para mostrar que la resistencia general en la población de la mancha de ojo en Francia ha disminuido. LINEAS BASE Y PROCEDIMIENTOS REGULADORES EN EUROPA Hasta inicios de los 1990 no había el requerimiento de que un producto sea comercializado y usado de acuerdo a una estrategia aprobada de manejo de la resistencia. El manejo de la resistencia y las estrategias empleadas para mantener la eficacia del producto eran voluntarias, en gran parte ayudadas por el trabajo de los Resistance Action Comittees (RACs) de la Global Crop Protection Federation (ahora Crop Life International). Fue agradable ver que debido a los problemas que la resistencia podía causar, la vasta mayoría de los productores comercializaban sus productos dentro de las pautas para el manejo de la resistencia decretadas por las RACs y que la mayoría de usuarios cumplían los consejos dados y así mismo cosechaban los beneficios. Esta posición cambio con la introducción e implementación de la EC Directive 91/414/EEC y subsiguientemente la Commission Directive 93/717/EEC. Ahora hay un requerimiento, como partir del proceso de registro de nuevos ingredientes activos y los productos que los contengan, y el re-registro de productos establecidos, de que

sesuministre información acerca del actual ó posible fenómeno de resistencia junto con los detalles de una estrategia de manejo para evitar la resistencia ò manejarla si ya está presente. Esto fue bien recibido por la industria pero planteo algunos problemas. Las directivas publicadas no dieron guías al solicitante para registro sobre que información era requerida para apoyar la aplicación y similarmente no dieron guías a los reguladores sobre que información esperar, ni como interpretarla cuando se suministre. Esta situación condujo a que se le pidiera a la European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO) que produjera una Pauta para que la usen los solicitantes y reguladores a fin de ayudarles a construir el expediente e interpretarlo respectivamente. Una revisión del proceso por el que se produjo esta Pauta es dado por McNamara & Smith (2000). La Pauta ahora ha sido revisada y extendida como un resultado de retroalimentación de la original. Ya que el suministro de datos de una línea base de sensibilidad es una parte significante del proceso, se presenta aquí un resumen de los requerimientos reguladores: Los requerimientos de datos y el proceso de análisis del riesgo La Pauta expone una vía sugerida de aproximación al problema de evaluar el riesgo del desarrollo de resistencia y luego de desarrollar estrategias para prevenir, limitar ò manejar su desarrollo. La Pauta no es un “requerimiento estatutario” pero se espera realmente que la mayoría de solicitantes sigan los formatos sugeridos y que los reguladores sigan la orientación dada en ella. Tal vez el factor más importante a caer en cuenta es que la responsabilidad esta en el solicitante para producir el análisis y para justificar las conclusiones y las estrategias propuestas de manejo de la resistencia. El proceso requiere que el solicitante considere varios aspectos que afecten el riesgo de usar el producto en un cultivo particular para controlar una plaga particular bajo condiciones particulares. Si se consideran los factores de riesgo si algún manejo de resistencia, entonces tiene que proponerse y justificarse una estrategia de manejo. Los detalles completos sobre los pasos involucrados están contenidos en la Pauta pero implican una evaluación de: Riesgo inherente: Este es un factor de riesgo que está generalmente más allá de nuestro control y aplica a ambos la plaga a ser controlada y el riesgo del ingrediente activo. Muchos patógenos e.g., mildeos polvosos de cereales, tizón tardío de la papa., moho gris (B. cinerea) son bien conocidos por ser capaces de desarrollar rápidamente resistencia. La introducción de un nuevo activo para su control automáticamente generará preocupación. Para los nuevos activos en todas las disciplinas, pero especialmente para el control de enfermedades de plantas, la historia ha mostrado como nosotros debemos esperar un riesgo moderado a alto de desarrollo de resistencia en ausencia de estrategias de manejo. Ya que muy pocos datos actuales pueden ser disponibles en el momento del registro de un nuevo activo para una nueva química, debe ser prudente considerar toda la nueva química que muestra un riesgo potencial de desarrollo de

resistencia. Estos factores de riesgo necesitan ser considerados y explicados en el expediente de registro, extraídos de la experiencia histórica donde sea aplicable. Riesgo agronómico El riesgo producido por la combinación de los riesgos de la plaga y del producto analizados como el “riesgo inherente” puede ser incrementado por ciertas condiciones de uso y conducir a una estimación del riesgo agronómico cuando no sea emplee estrategias de manejo de la resistencia. Tales factores incluyen el monocultivo, rotaciones cortas, el uso de cultivares susceptibles, etc. La lista completa es dada en Risk Análisis Guideline, OEPP/EPPO (2002). Modificadores Los modificadores pueden considerarse como cualquier medio por el que el riesgo no aceptable del uso no restringido del producto es reducido a un nivel aceptable. Ellos incluyen: • Reducir el número de aplicaciones del producto • Vender el producto como una mezcla coformulada con una pareja sin resistencia cruzada ó recomendar la aplicación de mezcla en el tanque con una pareja sin resistencia cruzada. • Recomendar programas específicos de aplicación que incluyan parejas sin resistencia cruzada. Esto tiene varias formas: o Recomendar alternancia con otros productos sin resistencia cruzada o Recomendar restricciones en el número de aplicaciones consecutivas (en bloques) con un nuevo producto • Recomendar sincronizaciones específicas en la aplicación de la aspersión para evitar excesiva presión de selección para la resistencia • Cualquier combinación de las de arriba Por supuesto, los diferentes modificadores pueden ser usados en diferentes ambientes ó para el mismo sistema de plaga-cultivo, y no se espera que la misma estrategia modificadora se aplique a todos los cultivos en que el producto será usado. Se espera que el solicitante produzca una estrategia de manejo basada en los modificadores declarados y explicar porque eso funcionara. Datos de apoyo Estudios de líneas base: Se espera que el solicitante proporcione evidencia de tener datos referencia línea base junto con un método de evaluación de la posible resistencia si se sospecha de ella. Modo bioquímico de acción, Modo de resistencia y Resistencia cruzada. Estos parámetros pueden ser muy útiles en la evaluación del riesgo de desarrollar resistencia. Desafortunadamente ellos son raramente conocidos para un nuevo activo a partir de una nueva química en el momento de la aplicación de la inscripción. Por

esta razón, la Pauta solicita que debe proporcionarse evidencia acerca de estos parámetros cuando se conozcan, pero si no se conocen, debe proporcionarse información sobre las pruebas completadas. Similarmente, debe proporcionarse la evidencia de resistencia cruzada, ó la falta de ella, a moléculas conocidas con problemas de resistencia. Evidencia para apoyar la estrategia. Siempre que se posible, el solicitante debe proporcionar datos que ilustren que la estrategia de manejo propuesta que incluya los varios modificadores no seleccionara a favor de la resistencia y permitirá dominar la población para que sea controlada. Por supuesto, esto puede ser difícil de hacer dados los plazos para el programa de desarrollo del nuevo producto antes de la entrega de la inscripción, pero se considera que en la mayoría de casos se puede reunir algunos datos. Estos incluirán la aplicación de la estrategia propuesta, el monitoreo de la respuesta de la población plaga a la aplicación, y la comparación con la línea base. Estrategia de implementación y monitoreo Se espera que el solicitante proporcione una etiqueta ejemplo del producto que deba explicar al usuario como usar el producto a fin de manejar la resistencia. El solicitante debe también informar al regulador como la estrategia propuesta será promovida en el mercado, y que pasos serán introducidos para permitir que el éxito de la estrategia sean monitoreados. APENDICE 1. DETERMINANDO UN MÉTODO DE ENSAYO, PROCEDIMIENTOS Y PARAMETROS DE EVALUACIÓN Una vez que se toma la decisión de establecer una línea base usando procedimientos de bioensayo, se debe desarrollar una técnica apropiada para crear la línea base. La técnica debe también ser apta de ser usada en las subsiguientes operaciones de monitoreo que investiguen el posible desarrollo de resistencia. Si para cuando se desarrolle la resistencia, es posible que se hayan desarrollado métodos más directos en ese momento, sin embargo el mismo método podrá ser usado para identificar los aislados tolerantes. Si la molécula es a partir de química conocida es bastante posible que la investigación ya haya establecido métodos apropiados. Si la molécula es tratada por un Grupo de Trabajo de la FRAC entonces las técnicas apropiadas pueden haber sido publicadas por la FRAC. Si, sin embargo, ninguna de estas situaciones se aplica entones se deben desarrollar nuevas técnicas, cualquiera in-vitro ó in-vivo. Las técnicas deben: * ser consistentes, confiables y repetibles * ser tan simples como sea posible para que operen en términos de la tecnología y habilidades del usuario

* ser tan baratas para operar como sea posible y capaces de un alto rendimiento en un corto periodo. Experimentación in-vitro La experimentación in-vitro puede ser ejecutada por ambos patógenos no obligados y obligados aunque para los últimos los métodos son generalmente restringidos a formas de evaluación que involucren la germinación de esporas. Pueden presentarse excepciones donde los generalmente aceptados patógenos obligados son aptos para ser cultivados en un medio de crecimiento especial e.g., Phytophthora infestans.

Patógenos no obligados Si los patógenos pueden ser cultivados fácilmente en agar artificial ú otro medio es razonable para la investigación empezar basando en este medio los procedimientos para el establecimiento de la dosis respuesta. La mayoría de las técnicas involucran el uso de un medio de agar “sólido” ya que es fácil observar los parámetros de crecimiento fungoso en la superficie, sin embargo son posibles técnicas usando medio líquido. Sin embargo, no todos los hongos no obligados ó fungicidas son apropiados para estas técnicas. Hongos como V. inaequalis pueden dar problemas debido a su lento crecimiento mientras que también se debe tener cuidado de asegurarse que las propiedades fisicoquímicas del fungicida sean apropiadas para obtener las concentraciones requeridas del fungicida en el medio prueba. Donde los fungicidas sean incorporados en agar ó en otro medio y la preparación tenga que ser esterilizada, debe tenerse cuidado de asegurarse que el procedimiento de esterilización no afecte al fungicida. El fungicida puede ser añadido antes del autoclave si es posible, de lo contrario debe añadirse justo antes del inicio de la prueba usando las apropiadas técnicas estériles. El medio de agar que contiene al fungicida puede ser preparado en lotes grandes y almacenado antes de usarlo para verterlo en platos Petri prueba a condición de que se hayan hecho pruebas para asegurar que los fungicidas no se degrade en el almacenamiento. Cuando se use un lote que se haya almacenado este debe ser mezclado eficientemente para asegurarse de la dispersión del fungicida en todo el medio. El producir un lote de platos Petri que contengan el medio prueba y su almacenamiento por más de siete días antes de su uso no es recomendable debido a que es posible que el fungicida migre a través del agar y de este modo conduzca a concentraciones falsas en las capas superficiales. Tal fenómeno se encontró para prochloraz y PDA(no publicado). Son posibles varias técnicas que incluyan la inhibición del crecimiento micelial, ensayos de germinación de esporas, y ensayos de elongación del tubo germinativo. La elección dependerá de las propiedades biológicas y físico-químicas del fungicida acopladas con la información disponible sobre su modo fisiológico y/ó bioquímico de acción. Por ejemplo, un ensayo de germinación de esporas no será aplicable para un fungicida que no actúa en esta parte del ciclo de vida del hongo, un medio rico en nutrientes no será la mejor elección para un patógeno que actúa por inhibición

enzimática si los nutrientes proporcionados en el medio evaden el modo de acción del fungicida (por ejemplo pyrimethanil). Las condiciones específicas usadas en los procedimientos prueba pueden solo ser determinadas por experimentación, con la fundamental preocupación de ser repetible. A este punto puede también ser necesario decidir si la línea base respuesta será establecida usando aislados individuales de esporas ó con una población de esporas ó aislados de masas miceliales. Cada técnica tiene sus partidarios y se pueden hacer argumentos científicos convincentes para cada método. Es posible que las consideraciones prácticas conduzcan la selección de la técnica. Aislados individuales de esporas: El factor importante a considerar cuando se inician trabajos con esporas individuales es si el hongo necesitara ser aislado del tejido vegetal y establecer las técnicas para obtener las esporas individuales para la experimentación. Debe también darle consideración a la variabilidad genética conocida que se presenta en el hongo y su estructura de población en el campo. Probar muchas esporas individuales de la misma lesión puede no ser representativo de la población en campo mientras que probar un sola espora a partir de lesiones individuales en donde cada una de las cuales viene de diferentes lugares puede potencialmente omitir los niveles bajos de variabilidad en las diferentes poblaciones. Poblaciones de esporas y aislados de masas miceliales: Estos procedimientos surgen cuando las lesiones individuales son consideradas como la unidad de muestreo. Se beneficia de ser fácil de operar y generalmente requiere un mínimo de sub-cultivos después del aislamiento desde la planta antes de que el hongo este listo para la experimentación. Sin embargo, la muestra prueba probablemente contendrá mucha variabilidad ya que puede comprender mas que un verdadero aislado. Esto puede producir una respuesta sesgada frente al fungicida dependiendo de las respuestas individuales de los aislados presentes, pero el uso de un número adecuado de muestras para la línea base es probable que minimice el problema. El uso de tales técnicas en los últimos ejercicios de monitoreo significara que debe de tenerse cuidado en la interpretación de los datos a partir de las mediciones debido a que la respuesta de la muestra será determinada por la respuesta del individuo presente menos sensible. Cuando los datos de la medición son comparados en varias épocas esto no tendrá ninguna consecuencia pero el usar tales datos para estimar la proporción de individuos resistentes en una población en una sola época proporcionara indudablemente un estimado sesgado (superior). Dese cuenta que los valores de sensibilidad obtenidos en las pruebas en placas de agar pueden ser influenciados por el medio prueba. Un valor EC50 determinado en un medio de agar puede no repetirse si se corre la misma prueba en otro medio. Procedimiento de evaluación: Los procedimientos de evaluación necesitan ser establecidos. Para ensayos basados en esporas, se necesitara tomar decisiones sobre lo que constituirá una espora germinada y como evaluar la inhibición del crecimiento del tubo germinativo. Un criterio frecuentemente usado es que una espora se considera que ha germinado cuando el tubo germinativo ha crecido hasta doble el diámetro de la espora, ó doblado el ancho de lo que sea aplicable. Donde el crecimiento del tubo germinativo este siendo evaluado, el probador debe decidirse

por los parámetros; la evaluación a intervalos de periodos de tiempo será importante y las mediciones pueden ser verdaderas evaluaciones lineales de los tubos germinativos ó estimados del porcentaje de crecimiento comparando con esporas no tratadas. Si a las esporas se les permite desarrollarse el ensayo puede estar basado en el micelio resultante, en donde los datos del caso pueden estar basados en ensayos de crecimiento radial. Para aislados de masas miceliales, el método normal involucrara la evaluación del % de inhibición del crecimiento micelial comparado al hongo cultivado en ausencia del fungicida prueba. Las mediciones del crecimiento son normalmente hechas en diámetros de dos colonias a ángulos rectos entre cada una y se calcula el radio promedio por colonia. Si el inóculo es un plug micelial a partir de una placa no tratada, este debe ser ubicado con la superficie micelial hacia abajo para asegurar el contacto con el medio prueba. Debe hacerse el examen del plug antes de tomar cualquier medición para asegurarse que el crecimiento fungoso que está siendo registrado esta creciendo actualmente en el medio prueba y no en el techo del plug “invertido”:

Las condiciones para la experimentación y la duración de las pruebas deben ser estandarizadas a fin de que se asegurar la repetición. Debe tenerse cuidado en asegurarse que las técnicas sean consistentes. Como un ejemplo, durante el anterior trabajo de desarrollo para prochloraz y la subsiguiente producción de líneas bases para mancha de ojo se entendió que el uso de prochloraz como el ingrediente activo no era apropiado. Si eran usadas vasijas de vidrio para la preparación química, el prochloraz era muy propenso de adherirse preferentemente a las paredes de la vasija de vidrio, conduciendo a considerables y variables errores en las concentraciones de las soluciones de prochloraz. El uso del producto formulado comercialmente en vez de usar el ingrediente activo resolvía estos problemas pero había que tener cuidado de asegurarse que todo el subsiguiente monitoreo fuera conducido usando la misma formulación comercial debido a que se encontraron que diferentes formulaciones producían diferentes resultados en las pruebas de crecimiento micelial en las placas de agar. La clasificación de los aislados en términos de valores de sensibilidad IG50 no habían cambiado, pero los valores actuales de IG50 si lo habían hecho. Cuando se empieza a desarrollar un protocolo prueba basado en el uso de productos formulados es también necesario asegurarse que ninguno de los formulantes tenga un efecto en el hongo. Muchos productos comerciales contienen varios humectantes, esparcidores y preservativos que pueden afectar el crecimiento fungoso in-vitro aún si ellos son considerados no fungicidas in-vivo. Patógenos obligados

Para patógenos obligados la experimentación in-vitro está restringida a las observaciones en esporas, excepto el caso de Phytophthora infestans donde las pruebas de crecimiento micelial son posibles. La mayoría de tales pruebas son llevadas a cabo en hongos de mildeo velloso, especialmente P. viticola donde las pruebas pueden evaluar los efectos del fungicida en la diferenciación de los esporangios ó determinar la concentración necesaria del fungicida para que restrinja la motilidad de las zoosporas. El uso de tales técnicas demanda un gran arreglo organizacional ya que los procedimientos deben estar en su sitio para recibir a los aislados fungosos desde su el campo. En el caso de P. viticola esto se consigue normalmente al transferir los aislados a plántulas jóvenes de uva y usar los subsiguientes esporangios frescos para la experimentación, usualmente conducidos en las fluidos de una microtitre plate. Este proceso tiene la ventaja de “purificar” los cultivos en el lugar de experimentación así como de proporcionar un poco más de flexibilidad en la organización de la prueba. Al mismo tiempo, mientras los procedimientos son usados durante las subsiguientes operaciones de monitoreo, el proceso ha de ser examinado de que posiblemente conduzca una perdida de cualquier aislado menos sensible durante el proceso de purificación. Donde haya preocupación esto debe ser investigado, pero esto es dudoso si el temor está justificado. Necesitan hacerse decisiones acerca de lo que constituye una muestra; si es una simple lesión ó si consiste de submuestras reunidas de la misma hoja, planta ó localidad. Debe establecerse algún grado de replicación en los procedimientos prueba y acordar criterios acerca de la aceptación de un resultado prueba valido. Se han de tomar decisiones de sí ó no almacenar aislados individuales para futura referencia, teniendo en cuenta que tal practica puede volverse muy costosa en términos de espacio y recursos físicos. Experimentación in vivo Los procedimientos in vivo serán necesarios para esos patógenos obligados para los que es imposible idear un procedimiento prueba in-vitro. Puede también ser deseable usar procedimientos in-vivo para patógenos no obligados si el uso de técnicas in-vitro es considerado inapropiado. En general, el uso de técnicas in-vivo es más fácil para patógenos no obligados que para patógenos obligados debido a que el transporte, almacenamiento y la subsiguiente preparación de las muestras antes de la prueba no involucran el uso de plantas vivas. Las muestras pueden ser aptas de ser transportadas y almacenadas como lesiones en material vegetal seco ó, subsiguiente al aislamiento en medio artificial, almacenadas como cultivos hasta que se requieran para la experimentación. Para patógenos obligados la situación es más compleja ya que deben haber condiciones disponibles para inocular plantas ó partes de la planta como parte del aislamiento/purificación y del procedimiento de almacenamiento así como de la técnica de prueba. Otras consideraciones incluyen un método para almacenar muestras y aislados si hay un momento de retraso entre el muestreo y la experimentación. Es más improbable que los aislados se puedan almacenar en

material vegetal seco así que se puede considerar el congelar los aislados para el almacenamiento. Si se toma está opción, se debe llevar a cabo investigación para confirmar que el ciclo de congelación/descongelación no afecta el perfil de sensibilidad, particularmente la posibilidad de incrementar la sensibilidad de un previamente “aislado menos sensible”. Será también necesario un suministro continuo de material vegetal durante el periodo de campaña prueba. Esto es muy relevante si una línea base y el subsiguiente monitoreo serán conducidos en otra época ó establecida para países de diferentes hemisferios. Es razonable asumir que por las razones de costo, recurso y espacio físico no será posible construir una línea base usando el mismo número de muestras que se usaron para la experimentación in vitro. Hay disponibles varios métodos y la elección se hará dependiendo del patógeno y de las propiedades del fungicida. Ellos abarcan desde el uso de partes vegetales separadas, posiblemente discos foliares flotantes como se uso para las fenilamidas y el propamocarb para P. viticola y P. infestans y P. infestans respectivamente ó segmentos foliares colocados en agar que contiene un fungicida para pruebas en donde puede usarse toda la planta joven, como para las estrobilurinas y V. inaequalis. Se hacen consideraciones similares en relación al trabajo con esporas individuales ó con aislados masas miceliales, aunque obviamente el uso del trabajo con esporas individuales involucra un mayor grado de aislamiento y multiplicación de la muestra que el trabajo con masas miceliales. Las evaluaciones normalmente se basaran en el control de la enfermedad expresado por el desarrollo de lesiones haciéndose observaciones extras en los efectos de la producción de esporas a partir de las lesiones. Estas técnicas deben ser estandarizadas, incluyendo el uso de una variedad particular de planta y la edad de las plantas usadas para la experimentación. Parámetros de evaluación Las líneas base pueden ser construidas usando parámetros como: • La dosis que da control total del aislado (Concentración Mínima Inhibidora, MIC). Esto puede aplicar a ambas técnicas in vitro en medio artificial ó para técnicas in vivo que involucren la evaluación del control de la enfermedad en las plantas prueba. • Los valores EC50 ó EC90, i.e., la dosis que reduzca el crecimiento ú otro parámetro (del micelio ó esporas) a un valor de 50% ó 90% de aquel que crecería en ausencia del fungicida. Estos valores son a veces referidos como IG50 ó IG90 (Inhibición del Crecimiento). Los valores MIC son obtenidos directamente a partir de las evaluaciones de la dosis de aplicación con el debido cuidado de conducir las pruebas con la replicación adecuada para reducir el error experimental. Los valores EC50 ó EC90 pueden ser determinados a partir de los datos de las respuestas a las dosis de aplicación mediante la aproximación estadística (recomendado) ó mediante el uso de una representación gráfica y la estimación del 50% ó 90% de puntos a partir de la gráfica. Cualquier método que sea usado debe tenerse cuidado de asegurarse de que el estimado sea razonable; el uso de un valor estimado EC50 ó EC90 que caiga fuera del

rango de dosis usado seguramente no será recomendado, particularmente cuando las dosis de aplicación están en una escala logarítmica.

APÉNDICE 2 UNA NOTA SOBRE LA DETECCIÓN DE LA RESISTENCIA Y EL TAMAÑO DE MUESTREO La detección de la resistencia durante una campaña de monitoreo depende de: • La frecuencia verdadera de los aislados resistentes en la población • El tamaño de muestreo evaluado Cómo estas connotaciones pueden ser ilustradas por los siguientes sencillos ejemplos: Caso 1: La VERDADERA frecuencia de la resistencia en una población es 1%. De este modo la población sensible es el 99%. Si nosotros tomamos 10 muestras individuales al azar a partir de está población y las probamos separadamente, la probabilidad de que ellas sean declaradas sensibles está dada por: 0.9910 = 90.43% La probabilidad de declarar que 1 de los 10 es resistente es: (10! x 0.999 x 0.01)/(1![9!]) = 9.1% La probabilidad de declarar que 2 de los 10 es resistente es: (10! x 0.998 x 0.012)/(2![8!]) = 0.42% Obviamente que con un tamaño de muestreo de 10 la mayor probabilidad es el encontrar solo un aislado resistente, pero las posibilidades de hacer esto son bajas. Si tenemos éxito, también estaríamos sobrestimando la verdadera posibilidad por un factor de 10 (1 en 10 en vez de 1 en 100). Caso 2: La VERDADERA frecuencia de resistencia es del 1% pero nosotros hacemos una muestra aleatoria de 50 aislados individuales y los probamos individualmente. En esta situación la probabilidad de declarar que todos los 50 aislados son sensibles, i.e., no encontrar ninguna resistencia, es de: 0.9950 = 60.5% La probabilidad de detectar un aislado resistente es: (50! x 0.9949 x 0.01)/(1![49!]) = 30.5% Claramente la probabilidad de detectar la resistencia se incrementa como el tamaño de muestreo de incremente, pero dese cuenta que aún si 1 aislado de los 50 fuera declarado resistente, la frecuencia observada sería del doble que la verdadera frecuencia (i.e., 1 entre 50 = 2% en vez del verdadero 1%)

Este proceso es resumido abajo: % DE PROBABILIDAD DE DETECTAR POR LO MENOS UN AISLADO RESISTENTE EN EL TAMAÑO DE MUESTREO DADO

La Tabla muestra que cuando la resistencia está a un nivel bajo es muy difícil detectarla sin tamaños de muestra grandes. Sin embargo, tales situaciones pueden ser evitadas al usar muestras reunidas. En estos casos, los no son probados individualmente sino probados como poblaciones que contienen muchas esporas. Lo racional detrás de esto es que en una muestra de 100 esporas, si ellas son probadas juntas como una muestra individual, si solo una de ellas es resistente la prueba puede dar un resultado positivo. La experimentación de varias muestras en masa incrementa de este modo en gran parte las posibilidades de detectar la resistencia. Tal proceso no dará una medida absoluta de la frecuencia de la resistencia en la población en un punto individual en el tiempo pero puede ser usado para medir su desarrollo en el tiempo. APENDICE 3 RIESGOS Y ERRORES Los siguientes comentarios son a partir de la experiencia del autor y son dados como una guía para cualquier individuo ó laboratorio que pretenda establecer una línea base y las subsiguiente campaña de monitoreo de la sensibilidad. Desviación de un protocolo Entre más sencillo el método, será el mejor, a condición de que genere datos confiables. Pero tenga cuidado. Recuerde que los métodos puedan ser copiados por otros laboratorios ó tal vez está usted copiando un método usted mismo. Considera

que cualquier desviación del método establecido puede producir cambios en un perfil de datos y conducir a conclusiones falsas, e.g., la declaración de un cambio en la sensibilidad cuando nada ha ocurrido ó aún una declaración de no cambio cuando ha sucedido en realidad el cambio. Como ejemplo, muchos métodos in vitro usan PDA para medio de crecimiento. Hay muchas fuentes de PDA, variando desde polvos disponibles comercialmente hasta recetas diseñadas para permitir al científico preparar medios a partir de papa y agar. El perfil de sensibilidad de un hongo probado en una forma de PDA probablemente diferirá de aquel derivado a partir de pruebas en otra forma. Esto puede suceder muy frecuentemente cuando el PDA se ha hecho in situ a partir de ingredientes al natural. Tal practica producir medios de diferentes estados nutricionales que se traducirán en variabilidad en los niveles de respuesta sensibilidad entre lotes del medio. Esta mejor definir un medio particular pre-preparado e.g., Oxoid ó Difco y usarlo para todas las pruebas. Personas diferentes pueden producir resultados diferentes En contra de lo que pueda parecer, esto puede suceder. La experiencia muestra que es mejor tener todo el trabajo conducido por el mismo técnico ó científico, ó grupos del mismo, tanto como sea posible. Las diferencias en los resultados no pueden ser tan grandes como aquellas creadas por una desviación a partir de los protocolos establecidos, pero pueden ser suficientes para causar preocupación. Es difícil explicar el por que estas diferencias se presentan. Ellas son más probablemente debidas a ligeras diferencias en la interpretación de un protocolo y de los procedimientos experimentales. Ellas pueden ser controladas al usar los aislados referencia estándar y, donde sea posible, un periodo de trabajo en grupo de tal forma que tales diferencias puedan ser identificadas y corregidas. Las líneas base son específicas a su laboratorio Esta es una extensión de los puntos dados arriba. Hay una equivocación común de que un laboratorio puede dedicarse a un ejercicio de monitoreo de la resistencia y usar otras líneas base publicadas por otros laboratorios. Tal procedimiento es altamente peligroso y es casi seguro que conduzca a conclusiones faltas. Debido a las diferencias en la interpretación de los procedimientos prueba, las diferencias en las condiciones del laboratorio y los procedimientos de evaluación, tal vez aún las diferencias en los datos obtenidos del fungicida prueba (ingrediente activo ó producto formulado) pueden no ser parte de la población de datos que han sido publicados. El único modo de evitar problemas es generar una línea base para un laboratorio particular ó intercambiar aislados referencia de tal forma que los laboratorios individuales puedan usar la “unión de datos” para permitir comparaciones validas. Un ejemplo de los problemas que pueden presentarse es dado para un estudio hecho para la evaluación de la sensibilidad de Tapesia spp. al prochloraz para los entonces Schering Agrochemicals. Tomaron parte cuatro centros de investigación en el estudio: Schering Agrochemicals en Chesterford Park, Plant Breeding Institute (antes de comercialización), IACR-Rothamsted y ADAS. Cada organización proporciono seis aislados de Tapesia spp. para la experimentación en todos los laboratorios. Se acordó

un protocolo estándar y se suministraron todos los materiales prueba a partir de un lote común. En teoría todos los laboratorios debían haber producido resultados idénticos, haciéndose la debida concesión a variación experimental. Este no fue el caso. Cuando los datos fueron reunidos y analizados fue claro que había diferencias numéricas significantes en los valores de sensibilidad encontrados entre laboratorios. Sin embargo, la clasificación de los aislados fue la misma independiente del laboratorio. La prueba también uso tres diferentes medios de prueba: PDA, agar malta y Czapek Dox. Se encontraron grandes diferencias en los valores de sensibilidad generados para estos medios. Los aislados fungosos fueron (numéricamente) más sensibles cuando se probaron con Czapek Dox y menos sensibles cuando se probaron en agar malta. Los datos para PDA estaban en la mitad de estos extremos. La lección era clara: era poco fiable usar los datos de sensibilidad generados a partir de un laboratorio para compararlos con los datos de línea base generados por otro laboratorio, pero las decisiones sobre la sensibilidad relativa de los aislados probados dentro de un laboratorio individual fueron validas y consistentes entre los laboratorios. Cuando sea posible, las investigaciones deben ser ejecutadas para que aseguren que los métodos usados in vitro se correlacionen bien con las pruebas hechas en plantas. La forma de la curva y su ubicación en un eje de dosificación puede variar de acuerdo al método usado para la determinación.

N. del T. Este artículo fue publicado de manera libre por la FRAC, y no es el interés ocasionarle daño a los autores ó a esa institución. Esto es un mero hobbie… ESTO NO ESTA REVISADO POR NADIE, ojo con eso….

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